基于HS-SPME-GC-MS法分析不同干燥條件對皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性成分的影響

秦玉川，吳德平，王麗玲，方 茹，賀 亮，王衍彬,*，錢 華，劉本同

（1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024）

皺環(huán)球蓋菇（Stropharia rugosoannulataFarl. ex Murrill），俗稱大球蓋菇，是球蓋菇科、球蓋菇屬大型可食用真菌，在我國分布于甘肅、云南、吉林、四川等多個省份[1]。皺環(huán)球蓋菇味道鮮、產(chǎn)量大，富含蛋白質(zhì)、多糖、多酚等多種生物活性物質(zhì)[2-3]，還具有緩解運動疲勞[4]、抗癌、降糖、抑菌[5]的作用，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織作為重點菇種向發(fā)展中國家推薦[6-7]。我國自20世紀(jì)90年代開始對皺環(huán)蓋菇進行大面積推廣栽培，國內(nèi)各地均有人工栽培，但由于其出菇期較為集中、水份含量高、收獲后呼吸作用強、鮮品貨架期短、深加工產(chǎn)業(yè)匱乏等原因，皺環(huán)蓋菇的栽培產(chǎn)業(yè)逐漸萎縮，一度僅在江南局部地區(qū)存有少量栽培[8]。近年來，隨著人們對鮮食口感的追求、食品冷鏈運輸?shù)陌l(fā)展與食用菌加工產(chǎn)業(yè)的進步，皺環(huán)球蓋菇的栽培開始回暖，逐漸成為國內(nèi)廣泛栽培菇種。

干燥工序操作簡單、成本低，是食品行業(yè)最古老、最有效的保鮮技術(shù)之一[9]。自然干燥、熱風(fēng)干燥、微波干燥、真空干燥和真空冷凍干燥是目前常用的食用菌脫水干燥方法[10]，但干燥也會導(dǎo)致食用菌營養(yǎng)和風(fēng)味成分的改變[11]。Tian Yuting等[12]報道了干燥技術(shù)對香菇風(fēng)味化合物的影響。Hu Su等[13]研究發(fā)現(xiàn)真空干燥能保持皺環(huán)球蓋菇中較高含量的可溶性糖、有機酸、游離氨基酸和5’-核苷酸，但呈味氨基酸的損失較大，而熱風(fēng)干燥和自然干燥對呈味氨基酸的影響較小，其中熱風(fēng)干燥產(chǎn)品等效鮮味濃度值最高，但目前干燥處理對皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響鮮見報道。揮發(fā)性成分是食用菌風(fēng)味的重要組成，也是影響產(chǎn)品品質(zhì)與消費者偏好的重要因素，脂肪族C8成分是食用菌釋放出的關(guān)鍵特征風(fēng)味化合物之一[14]，脂氧合酶與亞油酸的酶促反應(yīng)被認為是蘑菇中C8揮發(fā)物形成的原因，而干燥等熱加工過程中會導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的加速釋放[15]，影響最終產(chǎn)品的風(fēng)味。因此對揮發(fā)性成分的研究可用于產(chǎn)品品質(zhì)和不同干燥方式優(yōu)劣的評價。

氣相色譜結(jié)合各種風(fēng)味提取技術(shù)，如同時蒸餾萃取、溶劑萃取、靜態(tài)頂空、吹掃捕集、頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）等，均已被用于不同食品中的揮發(fā)性化合物的分析[16-19]，其中HS-SPME-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用法是近三十年發(fā)展出來的食品風(fēng)味成分鑒定技術(shù)，利用此方法進行食用菌的風(fēng)味成分檢測，無需通過萃取過程，可以對新鮮樣品直接吸附檢測，避免了時間、溫度或提取溶劑等因素對風(fēng)味成分造成影響，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食用菌揮發(fā)物的含量測定[20-22]。本實驗采用HS-SPME-GC-MS法對皺環(huán)球蓋菇新鮮樣品和不同干燥條件制得的樣品進行主要揮發(fā)性成分分析，獲得其關(guān)鍵風(fēng)味化合物組成與變化，以期為皺環(huán)球蓋菇的干燥加工提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺環(huán)球蓋菇樣品，品種金球18號，采自浙江省杭州市山稻與皺環(huán)球蓋菇復(fù)合栽培基地。

3-辛酮標(biāo)樣（98%純度） 上海吉至生化科技有限公司；甲醇（色譜純） 美國天地公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取裝置（配65 μm PDMS/DVB萃取針）德國Merck公司；7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Mtw-120電子天平 美國美樂公司；DB-2D金屬恒溫浴 美國Techne公司；DHG-9030烘箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FBS-760A鹵素快速水份測定儀深圳后王電子科技有限公司；FreeZone 2.5L冷凍干燥儀美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品干燥

新鮮樣品：基地采摘后，裝入潔凈PE袋，放入泡沫箱，加冰袋冷藏，1 h內(nèi)送至實驗室進行制備吸附。

烘箱干燥樣品：分別將采摘后的樣品，清理干凈，分別取10 支樣品，放入30、50、70、90 ℃烘箱內(nèi)干燥至含水率8%以下，備用。

冷凍干燥樣品：分別將采摘后的樣品，清理干凈，取10 支放入-70 ℃低溫冰箱預(yù)凍12 h，再放入冷凍干燥儀中，冷阱溫度-60 ℃，壓力15 Pa，干燥36 h，備用。

1.3.2 揮發(fā)性成分萃取條件

SPME萃取頭于250 ℃老化3 min；將樣品剪成均勻3 mm方形顆粒，稱取4.0 g樣品放于15 mL頂空瓶中，留出至少1/3的空間，將老化后的萃取頭插入樣品瓶上部，分別于40、60、80、100 ℃下吸附30 min。

1.3.3 揮發(fā)性成分分析條件

脫附時間2 min。GC條件：DB-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（He）流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至260 ℃，保持3 min。

MS條件：接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z15～550；定性庫NIST08。

1.3.4 揮發(fā)物含量測定

精確稱取1.000 0 g 3-辛酮標(biāo)準(zhǔn)品溶解于100 mL色譜純甲醇中，并依次稀釋配制成10、1.0、0.1、0.01 mg/mL樣品，備用。

GC-MS條件：進樣量0.1 μL，不分流，其他條件與1.3.3節(jié)同。

含量計算：以3-辛酮進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線和擬合方程，根據(jù)擬合方程計算樣品3-辛酮的吸附量，其他成分根據(jù)揮發(fā)物組成比例計算相對含量。

1.3.5 含水率測定

采用GB 5009.3—2016 《食品中水分的測定》第一法。

1.3.6 風(fēng)味活度值（odor activity value，OAV）計算

OAV按下式計算：

式中；Ci為化合物i的含量/（μg/kg）；Ti為化合物i的香氣感覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用WPS 2019，圖表繪制采用Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸附溫度對新鮮皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性成分測定的影響

圖1 不同吸附溫度皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of volatile components from S.rugosoannulata detected by GC-MS at different adsorption temperatures

吸附溫度對揮發(fā)性成分的影響較大，較低溫度下，主要以低沸點組分為主，高溫度下以高沸點組分為主，在高溫下，樣品會發(fā)生炭化且低沸點組分分解，因此選擇合適的吸附溫度對于HS-SPME非常關(guān)鍵。如圖1、表1所示，4種不同吸附溫度共鑒定出揮發(fā)性成分24種，其中醛類物質(zhì)3種、醇類物質(zhì)2種、酮類物質(zhì)2種、烯烴類物質(zhì)6種、烷烴類物質(zhì)8種、酸類物質(zhì)2種、酯類物質(zhì)1種。鑒定出揮發(fā)性成分的數(shù)量與吸附溫度呈顯著的正相關(guān)性，40 ℃吸附溫度下，僅鑒定出1種化合物，為食用菌特征性的C8化合物，而100 ℃吸附溫度下，鑒定出18種化合物，這可能與高溫導(dǎo)致原料中原本不易揮發(fā)的物質(zhì)析出有關(guān)，特別是烷烴與酯類化合物。從圖1和表1可以明顯看出，3-辛酮是新鮮皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性成分中的代表性化合物，特別是在近常溫（40 ℃）狀態(tài)，僅檢測到這一種揮發(fā)物。3-辛酮是具有很強滲透性果香的呈香物質(zhì)，天然存在于許多水果、豆類、薰衣草等植物中[23]，也是新鮮平菇、香菇、金針菇和雙孢菇[24]的主要揮發(fā)性成分，但皺環(huán)球蓋菇的水提液中并未發(fā)現(xiàn)[25]，這可能是3-辛酮易溶于大多數(shù)有機溶劑，但不溶于水的特性造成的。

表1 不同吸附溫度皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components of S. rugosoannulata detected at different adsorption temperatures

2.2 不同吸附溫度對新鮮皺環(huán)球蓋菇OAV分析

揮發(fā)物的組成并不能完全代表原料的風(fēng)味組成，為準(zhǔn)確判斷新鮮皺環(huán)球蓋菇主要揮發(fā)性成分，采用OAV法進行分析，OAV代表單一香氣成分對整體香氣的貢獻程度，因此在風(fēng)味研究中得到廣泛應(yīng)用。以特征性的C8化合物3-辛酮標(biāo)樣為基準(zhǔn)進行定量，獲得3-辛酮的線性擬合方程為y＝2.07×108x，R2＝0.999 9，不同吸附溫度獲得的主要風(fēng)味化合物含量與OAV結(jié)果見表2。

表2 不同吸附溫度下主要風(fēng)味化合物含量與OAV比較Table 2 Contents and odor activity value of major flavor compounds from S. rugosoannulata detected at different adsorption temperatures

從表2可以看出，對新鮮皺環(huán)球蓋菇風(fēng)味起主要作用的是3-辛酮、己醛、2-十一烷酮，其中3-辛酮含量與吸附溫度呈顯著負相關(guān)，橙花叔醇與2-十一烷酮與吸附溫度呈顯著正相關(guān)。特別是橙花叔醇，在40 ℃吸附溫度下未檢出，但100 ℃吸附溫度下含量已達1 861.08 μg/kg，成為所有揮發(fā)物中含量最高的物質(zhì)，占總揮發(fā)物的54.51%。僅考察風(fēng)味化合物的含量或相對組成，有時并不能完全說明原料的風(fēng)味組成，橙花叔醇由于感覺閾值較高，其OAV較低，對新鮮皺環(huán)球蓋菇風(fēng)味的貢獻并不大。新鮮皺環(huán)球蓋菇風(fēng)味主要貢獻化合物為3-辛酮、己醛與2-十一烷酮，3種化合物在不同溫度下的總OAV排序為：80 ℃（316.73）＞60 ℃（306.24）＞40 ℃（245.99）＞100 ℃（40.54），綜合OAV與風(fēng)味化合物數(shù)量數(shù)據(jù)，80 ℃的吸附溫度是皺環(huán)球蓋菇風(fēng)味檢測的最佳溫度，且己醛和3-辛酮對新鮮樣品風(fēng)味的形成具有重要貢獻。

2.3 新鮮皺環(huán)球蓋菇菌柄與菌蓋揮發(fā)物成分的差異分析

表3 皺環(huán)球蓋菇菌柄與菌蓋揮發(fā)性成分對比Table 3 Volatile components of S. rugosoannulata handle and cover

根據(jù)上述研究，采用80 ℃的吸附溫度對皺環(huán)球蓋菇的菌柄和菌蓋中的揮發(fā)性成分進行研究。從表3可以看出，皺環(huán)球蓋菇的菌柄和菌蓋中揮發(fā)性物質(zhì)與全菇吸附獲得的成分類似，共檢出17種成分，仍然是以3-辛酮、橙花叔醇、己醛等為主，特別是3-辛酮，分別占菌柄與菌蓋揮發(fā)性成分的70.83%和70.55%，是最主要的風(fēng)味化合物。但是菌柄和菌蓋中的揮發(fā)性成分還是存在一定差異，在菌柄中醛類、醇類、酮類、烯烴類、烷烴類和酯類化合物分別占總揮發(fā)物的0.93%、23.00%、71.57%、1.80%、2.05%與0.65%，而菌蓋中則分別占17.13%、4.04%、71.29%、3.14%、3.00%與0.85%，除酮類化合物外，其余種類化合物均有較大差異，菌蓋中醛、烯烴、烷烴、酯相對含量更高，菌柄中醇類化合物相對含量更高。另外，己醛、3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、十五烷在菌柄中未檢出，α-蓽澄茄油烯、去氫白菖烯在菌蓋中未檢出。

2.4 干燥條件對皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)物的影響

表4 不同干燥方式皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性成分對比Table 4 Volatile components of S. rugosoannulata subjected to freeze drying and hot-air drying

續(xù)表4

如表4所示，干燥皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)物共鑒定出68種化合物，其中雜環(huán)類12種、醛類6種、醇類8種、烯類15種、酮類6種、醚類1種、酸類1種、酯類4種、烷烴類15種。上述5 組樣品中，30 ℃干燥皺環(huán)球蓋菇樣品揮發(fā)性成分最為豐富，共鑒定出58種，90 ℃干燥樣品揮發(fā)性成分最少，共鑒定出17種。

食用菌含水率高，非鮮食產(chǎn)品需要干燥或深加工以延長貨架期，但由于食用菌對溫度非常敏感，選擇正確的干燥方法是成功保存的關(guān)鍵步驟。在熱干燥過程中，美拉德反應(yīng)所生成的有機物是食用菌干燥產(chǎn)品特定味道和香氣的重要來源[27]。不恰當(dāng)?shù)母稍锓椒ㄌ貏e是長時間高溫，會導(dǎo)致醇、酮、烯烴類等易揮發(fā)組分損失，烷烴和雜環(huán)化合物增加[15]。從表4也可以看出，干燥溫度對皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性組分具有非常大的影響，新鮮樣品中含量最高的3-辛酮在上述5 個樣品中均已無法檢出，而2-戊基呋喃、癸烯、橙花叔醇、苯甲醛、2-十一烷酮、香葉基香葉酮、十一烷等成為揮發(fā)性化合物的主要組成。且隨著干燥溫度的升高，醇、烯類化合物逐漸減少，這是由于醇、烯類化合物在熱處理過程可能發(fā)生了降解或揮發(fā)[28]。較高溫度下，烷類成分的顯著增加，可能是由于醇氧基的裂解反應(yīng)所造成[29]。雖然吡嗪類化合物在高溫條件下更易產(chǎn)生[30]，但在本研究中發(fā)現(xiàn)冷凍干燥和低溫?zé)岣稍锒籍a(chǎn)生了少量吡嗪類化合物，這可能是因為低溫下干燥需要較長時間，因此促使美拉德反應(yīng)發(fā)生。

圖2 主要揮發(fā)物種類組成（A）和主要化合物含量（B）Fig. 2 Composition of major volatiles (A) and contents of major individual compounds (B)

從圖2可以明顯看出，凍干樣品揮發(fā)物以雜環(huán)類物質(zhì)為主，30 ℃干燥樣品揮發(fā)物以烯類化合物為主，而較高干燥溫度（50～90 ℃）制得的樣品以烷烴為主，各類揮發(fā)物分別占總揮發(fā)物的36.68%、27.81%、31.28%、40.37%和79.50%。在所有鑒定出的揮發(fā)性成分中，凍干樣品相對含量最高為2-戊基呋喃（27.38%），30 ℃干燥樣品中相對含量最高為1-癸烯（17.17%），50 ℃干燥樣品中含量最高為十一烷（15.95%），70 ℃干燥樣品中含量最高為2-乙酰吡咯（18.22%），90 ℃干燥樣品中含量最高為十一烷（61.59%）。

3 討 論

皺環(huán)球蓋菇栽培簡單、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、味道佳，并具有抗疲勞、抗氧化抗腫瘤、降血糖等方面的功效，近年來栽培面積逐年增加，已遍布大江南北。但由于皺環(huán)球蓋菇產(chǎn)量大，畝產(chǎn)鮮菇可達5 000 kg以上（按播種面積300 m2計算）[8]，并存在上市時間集中、耐貯性差、貨架期短等問題，后續(xù)產(chǎn)品的加工需求必然旺盛。

無論哪種加工方式，風(fēng)味的保留程度或提升幅度必然是加工技術(shù)需要考慮的重要影響因素，而溫度則是影響風(fēng)味的關(guān)鍵參數(shù)之一?，F(xiàn)有食品原料風(fēng)味物質(zhì)的萃取方法中，SPME方法具有樣品量需求少、簡單快速、溶劑干擾小等優(yōu)點而被廣泛采用，并特別適合新鮮樣品的分析。本研究通過HS-SPME-GC-MS方法分析了新鮮和不同干燥溫度制得皺環(huán)球蓋菇樣品揮發(fā)性組分，新鮮樣品中共鑒定出17種揮發(fā)性成分，包括醛、酮、醇、酯和烷烴類化合物，其中含量最高的3種為3-辛酮、橙花叔醇和己醛，占全部揮發(fā)物的93.85%；皺環(huán)球蓋菇的菇柄與菇蓋揮發(fā)性物質(zhì)與全菇類似，含量最高的均為3-辛酮，且含量均占總揮發(fā)物的70%左右，但菇蓋中的醛（17.31%）、烯（3.00%）類化合物相對含量更高，而菇柄中醇（23.00%）類化合物相對含量更高。

食用菌各種風(fēng)味化合物的形成大多與脂質(zhì)氧化、蛋白水解、斯特雷克降解、美拉德反應(yīng)、酶和/或化學(xué)作用有關(guān)[31-32]，這些反應(yīng)分別發(fā)生在干燥過程的不同階段與不同溫度下。在干燥過程中，細胞被破壞，揮發(fā)性物質(zhì)從新鮮食用菌組織中釋放出來，當(dāng)酶從不同的細胞室分離出來時，會與有機底物相互作用[33]，在這一階段，食物中的各種脂肪酸、氨基酸和碳水化合物作為香氣前體，在酶的作用下被催化生成大量揮發(fā)性化合物[34]，許多揮發(fā)性化合物混合在一起形成了干燥食品的獨特香氣。在本研究的不同干燥條件下，揮發(fā)物成分發(fā)生了顯著的變化，首先從揮發(fā)物種類看，30 ℃樣品鑒定出58種，50 ℃、冷凍干燥、70 ℃和90 ℃樣品，分別鑒定出38、34、19種和17種化合物；從揮發(fā)物的組成看，30 ℃干燥樣品的風(fēng)味最為豐富，所鑒定出的58種化合物中相對含量超過1%的共20種，占總揮發(fā)物的80.07%，包括吡嗪、呋喃等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與醛、醇、烯、酮、酯、烷等揮發(fā)性化合物，但5種樣品中均未檢出新鮮樣品中含量最高的3-辛酮，說明干制品對皺環(huán)球蓋菇的風(fēng)味影響極大。過高的加工溫度使皺環(huán)球蓋菇的風(fēng)味損失嚴(yán)重，并會產(chǎn)生大量烷烴類物質(zhì)，其中高溫樣品（90 ℃）已完全喪失菇類應(yīng)有的氣味，揮發(fā)物中含量最高的十一烷占總揮發(fā)物的比例高達61.59%。冷凍干燥是一種真空低溫干燥技術(shù)，采用冷凍干燥制得的皺環(huán)球蓋菇形態(tài)與營養(yǎng)保持應(yīng)為最佳，但本實驗僅鑒定出34種揮發(fā)性成分，含量最高的是2-戊基呋喃，占總揮發(fā)物的27.38%，而烯類化合物僅鑒定出5種（30 ℃樣品為14種），這應(yīng)該與冷凍干燥加工過程中的高真空有關(guān)，在15 Pa甚至更高的真空度下，易揮發(fā)的烯、醇、酮等化合物損失嚴(yán)重，而保留了原始熱揮發(fā)性成分、烷烴和雜環(huán)類揮發(fā)性成分，這與Pei Fei等[15]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

通過對不同吸附溫度皺環(huán)球蓋菇主要揮發(fā)性成分組成、含量與OAV的比較，獲得皺環(huán)球蓋菇SPME最佳吸附溫度80 ℃。采用HS-SPME-GC-MS方法分析皺環(huán)球蓋菇新鮮樣品、冷凍干燥樣品與不同干燥溫度樣品的揮發(fā)性組分，研究發(fā)現(xiàn)：皺環(huán)球蓋菇新鮮樣品揮發(fā)性組分以3-辛酮、橙花叔醇、己醛、1-己醇、2-十一烷酮為主，其中主要風(fēng)味貢獻化合物為3-辛酮、己醛和2-十一烷酮。皺環(huán)球蓋菇的菇蓋與菇柄揮發(fā)性成分中3-辛酮相對含量相近（70.55%與70.83%），醛、烯、醇類化合物存在較大差異，分別占總揮發(fā)物的17.31%與0.93%、3.00%與2.08%、4.40%與23.00%；加工溫度對皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)性組分的影響巨大，溫度越高，揮發(fā)性組份損失越嚴(yán)重，并會產(chǎn)生大量的烷烴化合物，90℃干燥樣品中烷烴類化合物已占總揮發(fā)物的79.50%；30 ℃干燥樣品的揮發(fā)物組成最為豐富，共鑒定出58種化合物，包括醛、烯、醇、酯等化合物，以及吡嗪類、呋喃類等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。風(fēng)味物質(zhì)的保留與提升向來是考量食品貯藏與加工技術(shù)的重要指標(biāo)之一，鑒于皺環(huán)球蓋菇揮發(fā)物相關(guān)研究尚未見報道，希望本研究可以為皺環(huán)球蓋菇的精深加工提供數(shù)據(jù)參考。