大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸復(fù)合Pickering乳液制備及其穩(wěn)定性分析

許馨予，楊鵠雋,2，賈 斌,3，張慧敏,3，左 鋒,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江 大慶 163319）

Pickering乳液指超微固體顆粒經(jīng)高速剪切乳化后被吸附在油水界面而形成的乳化液，具有粒徑分布可控、制備方法簡單等優(yōu)點，其穩(wěn)定性取決于固體顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)及界面層的黏彈性[1-2]。一般的無機表面活性劑具有一定毒性，在食品工業(yè)中應(yīng)用受限。因此，選擇生物大分子代替表面活性劑制備Pickering乳液，如蛋白質(zhì)、多糖、纖維素、淀粉等，這些物質(zhì)是構(gòu)成食品的主要營養(yǎng)成分，不僅能夠為機體提供能量，維持新陳代謝，還具有一定抗氧化能力，起到預(yù)防慢性疾病發(fā)生的作用[3-5]。

單一大分子物質(zhì)制備的Pickering乳液穩(wěn)定性及流變特性較差，而通過分子間交聯(lián)制備的復(fù)合乳液則表現(xiàn)出良好的理化性質(zhì)。鞠夢楠等[6]對大豆球蛋白與花青素共價復(fù)合Pickering乳液進(jìn)行研究，得到的復(fù)合乳液與大豆球蛋白乳液相比，乳化性增至127 m2/g，乳化穩(wěn)定性升高近1 倍，油滴狀態(tài)發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)出明顯的橋接乳液狀態(tài)。Feng Tingting等[7]利用豌豆分離蛋白-高甲氧基果膠-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復(fù)合物制備高內(nèi)相Pickering乳液，結(jié)果表明復(fù)合物具有一定的表面濕潤性，復(fù)合乳液形成了穩(wěn)定的界面層，復(fù)合顆粒均勻包裹油滴，表現(xiàn)出較高的乳液穩(wěn)定性。馬翠翠等[8]利用熱誘導(dǎo)及靜電處理構(gòu)建乳鐵蛋白-多糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯三元復(fù)合物以用來遞送姜黃素，結(jié)果表明多糖參與形成的雙層乳液能有效阻止液滴的聚集，抑制姜黃素的降解，提高姜黃素的生物可及性和貯藏穩(wěn)定性。Yi Fengping等[9]為制備一種親脂性功能食品的保護(hù)傳遞介質(zhì)，采用共價交聯(lián)技術(shù)將大豆分離蛋白與沒食子酸結(jié)合并制備Pickering乳液，得到的乳液在堿性條件下粒徑小、Zeta電位高，具有較高穩(wěn)定性，此外，在不添加防腐劑的前提下，添加較高濃度沒食子酸的組分還表現(xiàn)出一定的抗菌能力。復(fù)合乳液具有良好的表面濕潤性、界面性質(zhì)，能夠促進(jìn)界面吸附，并形成穩(wěn)定的界面層，在親脂性功能食品的運輸及貯藏領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。

果膠作為天然植物多糖，無毒無味，且具有良好的乳化穩(wěn)定性及增稠特性[10]，其與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的共價復(fù)合物是制備Pickering乳液重要原料，但二元復(fù)合物的理化性質(zhì)較差可能導(dǎo)致復(fù)合物流變特性及穩(wěn)定性等方面不足[11]，Jie Yang等[12]報道將多酚應(yīng)用于蛋白質(zhì)-多糖體系中可以通過酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用增強復(fù)合物的表面疏水性，從而改變其流變特性及穩(wěn)定性，因此通過選擇合適原料構(gòu)建一種三元復(fù)合物，提升復(fù)合乳液穩(wěn)定性、拓展其在親脂性食品中的貯存和運輸具有重要意義。本研究以大豆分離蛋白、高酯柑橘果膠及沒食子酸作為研究對象，制備一種蛋白質(zhì)-多糖-多酚基復(fù)合物，通過正交試驗對其制備的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用流變特性、粒徑分布、Zeta電位進(jìn)對Pickering乳液性能進(jìn)行表征，結(jié)合復(fù)合乳液的微觀形態(tài)特征，探討其形成及穩(wěn)定機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白、高酯柑橘果膠、沒食子酸、茶籽油，以上均為食品級。

鹽酸、氫氧化鈉、疊氮磷酸二苯酯（diphenyl azidophosphate，DPPA），均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600i紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司；FM-30D數(shù)顯高剪切分散乳化機 德國弗魯克儀器有限公司；ARES-G2流變儀 美國TA儀器有限公司；Nano-v4電位儀 馬爾文儀器有限公司；DM-750光學(xué)顯微鏡 北京普瑞賽斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸復(fù)合物制備

參考Feng Tingting等[7]的研究方法，略有修改。

1）將30 g大豆分離蛋白分散在1 500 mL蒸餾水中（20 mg/mL），在室溫下攪拌60 min，在4 ℃沉淀過夜。將pH值調(diào)整到12，溶液在90 ℃加熱30 min。

2）將30 g高酯柑橘果膠溶解在1 500 mL蒸餾水中攪拌60 min，持續(xù)攪拌，制備果膠（20 mg/mL）原液，在4 ℃沉淀過夜。

3）大豆分離蛋白和高酯柑橘果膠溶液以1∶1（V/V）混合，用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)整pH值（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5），以350 r/min攪拌60 min。將不同量的沒食子酸（30、60、90、120、150 mg）溶解在120 mL大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠溶液中，加入0.02 mL DPPA，以防止微生物感染，在不同溫度下（25、35、45、55、65 ℃）持續(xù)攪拌60 min，取出，在波長600 nm處測其吸光度。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以pH值、溫度、沒食子酸含量為因素，以波長600 nm處的吸光度為評價指標(biāo)，設(shè)計3因素3水平正交試驗優(yōu)化各因素，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.2 場發(fā)射掃描電子顯微鏡表征

參照周濃等[13]的方法，取大豆分離蛋白、大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸復(fù)合物，進(jìn)行固定、噴金，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡各放大100 倍和500 倍，觀察微觀結(jié)構(gòu)特性。

1.3.3 Pickering乳液制備

參照Liu Zhongbo等[14]的方法，略有修改。利用高速剪切乳化機將200 mL不同油相體積分?jǐn)?shù)φ（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8）的茶籽油與復(fù)合溶液在12 000 r/min均質(zhì)2 min制備Pickering乳液。

1.3.4 流變特性

采用動態(tài)流變儀測定不同含油量的Pickering乳液的動態(tài)黏彈性，測試參數(shù)：采用C35/1 Ti錐板，間距1 mm，頻率掃描范圍0.1～50 Hz，應(yīng)力1.0%，測定溫度25 ℃。

1.3.5 乳液粒徑及Zeta電位

采用后向散射動態(tài)光散射法，在25 ℃分析復(fù)合物的粒徑和粒徑分布，散射角為173°，根據(jù)累積平均粒徑，通過Stokes Einstein方程計算粒徑。根據(jù)多分散指數(shù)測量粒度分布，所有樣品測定3 次。

將樣品添加到配備有電極的反應(yīng)杯中，溫度保持在25 ℃，測定Zeta電位。

1.3.6 Pickering乳液穩(wěn)定性

利用光學(xué)顯微鏡，在40 倍物鏡下觀察乳滴形態(tài)[15]。

1.3.6.1 離心穩(wěn)定性

取乳液40 mL于離心管中，以5 000 r/min離心10 min后取出，觀察并記錄乳液表面出油及分層情況。

1.3.6.2 冷藏穩(wěn)定性

取10 mL乳液置刻度離心管中，加蓋密封，保持直立狀態(tài)置4 ℃冰箱中冷藏。20 d后觀察并記錄乳液表面出油及分層情況。

1.3.6.3 冷凍穩(wěn)定性

取10 mL乳液置刻度離心管中，加蓋密封，保持直立狀態(tài)置-20 ℃冰箱中冷凍保存。每隔一段時間觀察并記錄乳液表面出油及分層情況。

1.3.6.4 pH值穩(wěn)定性

取乳液5 mL于刻度離心管中，分別加入5 mL pH 4.0、7.0、10.0的HCl或NaOH溶液，攪拌混勻，加蓋密封，室溫貯存。20 d后觀察記錄乳液表面出油及分層情況。

1.3.6.5 鹽離子穩(wěn)定性

取乳液5 mL于刻度離心管中，分別加入5 mL濃度為0、100、200、300 mmol/L的NaCl溶液中，攪拌混勻，加蓋密封，室溫下貯存。每隔一段時間觀察并記錄乳液表面出油及分層情況。

1.3.6.6 熱穩(wěn)定性

取乳液10 mL于試管中，加蓋密封，將試管分別置于30、60、90 ℃水浴鍋中加熱，12 h后觀察并記錄乳液表面出油及分層情況。

1.3.6.7 常溫貯存穩(wěn)定性

取乳液各10 mL于離心管中，于室溫靜置，20 d后觀察并記錄乳液外觀分層及表面出油情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

蛋白質(zhì)-多糖-酚類復(fù)合物的結(jié)合程度決定其表面濕潤性，表面濕潤性增強能夠進(jìn)一步提升界面性能，促進(jìn)油滴在界面吸附和積累，有助于形成穩(wěn)定的Pickering乳液[16]。因此選取pH值、溫度、沒食子酸含量作為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗，對復(fù)合物制備條件進(jìn)行優(yōu)化，利用600 nm波長處的吸光度對復(fù)合物結(jié)合程度進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1所示。

由圖1A可知，隨著pH值升高，復(fù)合物的吸光度呈上升趨勢，在pH 3.5時達(dá)到最大，為2.982±0.001，此時pH值小于蛋白質(zhì)等電點，大豆分離蛋白和沒食子酸均帶正電荷，溶液中離子攜帶的正負(fù)電荷數(shù)接近平衡，形成緊密的靜電復(fù)合物[17]；當(dāng)pH值繼續(xù)升高，吸光度略下降，此時大豆分離蛋白溶液整體帶負(fù)電荷，只有少部分官能團(tuán)及沒食子酸與果膠靜電吸引[18]。由圖1B可知，25～35 ℃時，隨溫度升高，吸光度逐漸上升，最高可達(dá)2.861±0.004，這是由于在一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)溶解度隨溫度上升而升高，體系中正電荷增多，使結(jié)合反應(yīng)的激烈程度升高[19]；但溫度繼續(xù)升高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，復(fù)合物穩(wěn)定性降低，從而使結(jié)合常數(shù)變小[20]。由圖1C可知，在一定范圍內(nèi)隨著沒食子酸含量的升高，溶液的吸光度逐漸增大，當(dāng)沒食子酸含量高于40 mg時，繼續(xù)升高沒食子酸含量溶液吸光度無顯著改變（P＞0.05），這說明溶液中沒食子酸含量達(dá)到40 mg后，復(fù)合物形成趨于穩(wěn)定，反應(yīng)的激烈程度趨于平緩，不再生成新的復(fù)合物，此時溶液的吸光度為2.888±0.000。

圖1 pH值（A）、溫度（B）、沒食子酸含量（C）對吸光度的影響Fig. 1 Effect of pH (A), temperature (B) and gallic acid content (C) on the absorbance of the complex

2.2 正交試驗結(jié)果分析

以單因素試驗為基礎(chǔ)，設(shè)計3因素3水平正交試驗，結(jié)果如表2所示，通過極差分析，各因素對溶液吸光度的影響大小為pH值＞溫度＞沒食子酸含量；最優(yōu)組合為A3B2C2，即pH 4.5、溫度35 ℃、沒食子酸含量40 mg，此條件下吸光度為3.082。

表2 復(fù)合物正交試驗方案與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results

2.3 掃描電鏡分析

如圖2所示，大豆分離蛋白呈松散的形態(tài)分布，不能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；而大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸復(fù)合物呈聚合的均勻網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明本研究中高酯柑橘果膠和沒食子酸能與大豆分離蛋白結(jié)合形成緊密的復(fù)合物，從而改變大豆分離蛋白的微觀結(jié)構(gòu)。李春翼等[21]對麥醇溶蛋白-蘆丁復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合物致密多孔，呈現(xiàn)蜂窩狀，并且復(fù)合物表現(xiàn)出良好的乳化性及乳化穩(wěn)定性。

圖2 大豆分離蛋白（A、B）和大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸復(fù)合物（C、D）微觀結(jié)構(gòu)Fig. 2 Microstructure of SPI (A, B) and SPI-HMCP-GA complex (C, D)

2.4 流變特性分析

對不同油相體積分?jǐn)?shù)的Pickering乳液進(jìn)行動態(tài)黏彈性分析，得到結(jié)果如圖3所示。由圖3A可知，隨著剪切頻率的增加，儲能模量（G’）均高于損耗模量（G”），且呈現(xiàn)出明顯的頻率依賴性。隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加，G’和G”整體呈上升趨勢，油相體積分?jǐn)?shù)為0.7時達(dá)到最大，說明當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.7時，乳液的彈性和黏性最好，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更強，具有更高的穩(wěn)定性。通過G’及G”計算得到損耗角正切值（tanδ），如圖3B所示，隨著頻率的升高，tanδ呈現(xiàn)降低后升高的趨勢，Zhu Cuiping等[22]研究發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白-低甲氧基果膠復(fù)合乳液的tanδ呈規(guī)律性下降，表明彈性相對于黏性在變強，因此本研究中乳液的彈性先升高后降低，而黏性則先降低后升高，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)不高于0.5時更為明顯。tanδ始終小于1，說明乳液的G’始終小于G”，乳液呈現(xiàn)類似于固體的形態(tài)，表現(xiàn)出典型的弱凝膠黏彈性行為[23]。此外，tanδ與油相體積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，Zhang Chen等[24]對果膠-纖維素復(fù)合乳液的研究結(jié)果表明，tanδ越小，體系顯示出更具有彈性的流體性質(zhì)，這說明乳液油相體積分?jǐn)?shù)越大，凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越強，在油相體積分?jǐn)?shù)為0.7時基本達(dá)到穩(wěn)定。

圖3 Pickering乳液的G’、G”（A）及tanδ（B）變化Fig. 3 Frequency-dependent changes in G’, G” (A) and tanδ (B) of Pickering emulsion

2.5 粒徑及Zeta電位分析

乳液粒徑越小，乳析速率越慢，則乳液穩(wěn)定性越強[25]。對不同油相體積分?jǐn)?shù)的復(fù)合乳液平均粒徑進(jìn)行表征，結(jié)果如圖4A所示，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為0.4時，乳液平均粒徑為（343.08±6.29）nm，隨著油相體積分?jǐn)?shù)升高，乳液平均粒徑呈顯著降低趨勢（P＜0.05），當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.7時趨于穩(wěn)定，不再降低（P＞0.05），此時乳液的平均粒徑為（220.36±7.13）nm。這是由于茶籽油中含有大量表面活性物質(zhì)，油相體積分?jǐn)?shù)增大有助于增強乳液的分散程度，使油滴分散成更小的顆粒[26]，因此油相體積分?jǐn)?shù)越大，乳液越穩(wěn)定，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.7時，乳液穩(wěn)定性基本達(dá)到最大。

Pickering乳液顆粒間的排斥力決定乳液穩(wěn)定性，Zeta電位的絕對值越大，說明分子間靜電斥力越大，液滴之間不容易絮凝，乳液穩(wěn)定性則越高[27]。對不同油相體積分?jǐn)?shù)制備的Pinkering乳液的Zeta電位進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4B所示，不同油相體積分?jǐn)?shù)制備的乳液均表現(xiàn)出強靜電斥力，且隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增大，乳液的Zeta電位絕對值由（36.56±0.93）mV逐漸增加至（55.49±7.97）mV，這說明分子間的靜電斥力增大，乳液穩(wěn)定性升高；而當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)不低于0.7時，顆粒電位趨于穩(wěn)定，不再發(fā)生顯著改變（P＞0.05），這說明當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.7時，乳液較穩(wěn)定，繼續(xù)升高油相體積分?jǐn)?shù)，乳液穩(wěn)定性不再發(fā)生明顯變化，與對乳液平均粒徑的研究結(jié)果一致。

圖4 油相體積分?jǐn)?shù)對平均粒徑（A）及Zeta電位（B）的影響Fig. 4 Effect of oil phase volume fraction (φ) on average particle size (A) and zeta potential (B)

2.6 Pickering乳液穩(wěn)定性分析

復(fù)合物在一定的溫度、pH值、時間、離子強度等條件下產(chǎn)生協(xié)同增效作用，對Pickering乳液的穩(wěn)定性也有一定影響[28]，通過對乳液微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，可以得到其在不同條件下的物理性能及乳化穩(wěn)定性等一系列指標(biāo)。

2.6.1 離心穩(wěn)定性

復(fù)合物與茶籽油混合并進(jìn)行高速剪切乳化后均未出現(xiàn)析乳、析油現(xiàn)象，制得的Pickering乳液為W/O型的均一乳液，乳液質(zhì)量較好。將5種乳液離心并對其離心穩(wěn)定性進(jìn)行探究，結(jié)果如圖5所示，5種乳液均未出現(xiàn)析油現(xiàn)象，但表現(xiàn)出一定的析乳現(xiàn)象，這是由于離心加速了乳液乳化過程，迫使液滴濃縮，多余的水分會被分離，造成析乳[29]。此外，隨著油相體積分?jǐn)?shù)升高，析乳現(xiàn)象逐漸減弱，表明乳液穩(wěn)定性隨油相體積分?jǐn)?shù)的升高而逐漸升高。Wang Lijuan等[29]對玉米醇溶蛋白-殼聚糖復(fù)合乳液進(jìn)行研究，經(jīng)離心同樣出現(xiàn)析乳現(xiàn)象，離心過程中均未出現(xiàn)乳液破碎現(xiàn)象，乳液具有抵抗離心引力的應(yīng)力，說明本研究的Pickering乳液具有較高的穩(wěn)定性。

圖5 不同油相體積分?jǐn)?shù)的Pickering乳液離心后狀態(tài)Fig. 5 Effect of oil phase volume fraction on centrifugal stability of Pickering emulsion

2.6.2 冷藏及常溫貯存穩(wěn)定性分析

冷藏及常溫貯存對不同油相體積分?jǐn)?shù)的Pickering乳液穩(wěn)定性的影響如圖6所示，隨著油相體積分?jǐn)?shù)升高，乳液中油滴的粒徑逐漸減小，與2.5節(jié)中對乳液平均粒徑的研究結(jié)果相同，說明隨著油相體積分?jǐn)?shù)升高，乳液穩(wěn)定性逐漸增強。

經(jīng)過4 ℃及25 ℃貯存20 d后，5 組乳液均未出現(xiàn)析油現(xiàn)象，說明乳液W/O組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。冷藏條件下油相體積分?jǐn)?shù)為0.4的乳液出現(xiàn)明顯析乳現(xiàn)象，其余組分析乳現(xiàn)象不明顯，說明油相體積分?jǐn)?shù)為0.4時乳液穩(wěn)定性較弱；而常溫貯存條件下，所有組分均出現(xiàn)明顯析乳現(xiàn)象，且隨著油相體積分?jǐn)?shù)的升高，析乳現(xiàn)象明顯降低，說明乳液穩(wěn)定性呈現(xiàn)升高趨勢。兩種貯存條件下的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，在油相體積分?jǐn)?shù)低于0.7時，一部分組分雖未出現(xiàn)明顯的析油、析乳現(xiàn)象，但微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明乳液粒徑明顯增大，乳液穩(wěn)定性下降；而油相體積分?jǐn)?shù)不小于0.7的兩組貯存前后粒徑及分布無明顯變化，說明此條件下乳液穩(wěn)定性更強。此外，與25 ℃常溫貯存相比，4 ℃冷藏條件下析乳現(xiàn)象更弱，油滴粒徑變化更小，不容易出現(xiàn)油滴分布不均的現(xiàn)象，這可能是由于常溫條件下更適宜微生物生長繁殖而對營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖等）造成破壞，從而破壞乳液結(jié)構(gòu)[30]，說明乳液更適宜在4 ℃條件下貯存。

2.6.3 熱穩(wěn)定性分析

在不同熱處理條件下的乳液穩(wěn)定性的結(jié)果如圖7所示，所有組分均未出現(xiàn)明顯的析油情況，說明乳液W/O結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；加熱條件下只有油相體積分?jǐn)?shù)為0.4時出現(xiàn)較明顯的析乳現(xiàn)象，這是由于此時乳液中復(fù)合溶液體積分?jǐn)?shù)較大，致使含水量較高而導(dǎo)致[13]；此外，隨熱處理溫度升高，析乳情況逐漸強烈，說明乳液穩(wěn)定性被進(jìn)一步降低。

對乳液微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察得到類似結(jié)果，油相體積分?jǐn)?shù)越大，乳液粒徑越小，液滴密度越大，大小均一，乳液穩(wěn)定性強；而隨著溫度升高，乳液粒徑有明顯的增大趨勢，且分布的均一性減弱，乳液穩(wěn)定性降低；相比之下，油相體積分?jǐn)?shù)為0.7和0.8時，液滴粒徑隨溫度變化不明顯，乳液穩(wěn)定性更強。

圖6 不同油相體積分?jǐn)?shù)的Pickering乳液常溫儲藏及冷藏20 d后的微觀形態(tài)（×40）Fig. 6 Microstructure of Pickering emulsion with different oil phase volume fractions after 20 days of storage at cold and ambient temperature (× 40)

圖7 不同油相體積分?jǐn)?shù)的Pickering乳液熱處理后的微觀形態(tài)（×40）Fig. 7 Micromorphology of Pickering emulsion with different oil phase volume fractions after heat treatment (× 40)

圖8 不同油相體積分?jǐn)?shù)的Pickering乳液冷凍后的微觀形態(tài)（×40）Fig. 8 Micromorphology of Pickering emulsion with different oil phase volume fractions after freezing (× 40)

2.6.4 冷凍穩(wěn)定性分析

冷凍條件對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響如圖8所示。冷凍后所有乳液均出現(xiàn)不同程度的析油現(xiàn)象，隨著油相體積分?jǐn)?shù)升高和冷凍時間的延長，析油程度逐漸增強，乳液呈現(xiàn)絮狀，這可能是由于長時間的低溫環(huán)境破壞了大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸復(fù)合物結(jié)構(gòu)，使液滴外層的界面層遭到破壞，油脂被釋放而導(dǎo)致[31]。

微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，冷凍10 d后的乳液液滴發(fā)生明顯聚集，乳滴粒徑增大，乳液穩(wěn)定性明顯下降；且隨著油相體積分?jǐn)?shù)升高和冷凍時間的延長液滴粒徑逐漸增大，這是由于界面層較薄，油滴絮凝并聚集導(dǎo)致[13]?？偠灾?，乳液不適宜冷凍貯存，長期低溫環(huán)境會大大降低乳液穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致乳液質(zhì)量下降。

2.6.5 pH值穩(wěn)定性分析

不同pH值條件下的Pickering乳液貯存后的形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖9所示。乳液制備后的24 h內(nèi)未出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，乳液不發(fā)生聚集行為，說明乳液在短時間內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。貯存20 d的乳液分層現(xiàn)象逐漸明顯，乳液發(fā)生聚集，并存在不同程度的析乳行為，其中油相體積分?jǐn)?shù)為0.4時，析乳情況最明顯，這是由復(fù)合溶液體積分?jǐn)?shù)大而導(dǎo)致；隨著油相體積分?jǐn)?shù)的升高，析乳情況逐漸減弱，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為0.8時幾乎不發(fā)生析乳。但在不同pH值條件下，析油情況不同，pH 4時未出現(xiàn)析油現(xiàn)象；pH 7～10時出現(xiàn)較明顯的析油現(xiàn)象，且隨著pH值升高，析油現(xiàn)象逐漸明顯，這說明此時油滴的組織結(jié)構(gòu)遭到了強烈破壞，乳液穩(wěn)定性仍舊會降低。

對貯存20 d的乳液進(jìn)行微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)表征，可以看出，油相體積分?jǐn)?shù)和pH值均對乳液穩(wěn)定性有較大影響。相比較下，pH 4時乳滴粒徑總體較小，這是由于此時接近大豆分離蛋白的等電點，大豆分離蛋白與高酯柑橘果膠分子靜電互斥作用強烈，乳液較穩(wěn)定[32]。此外，乳滴粒徑總體隨油相體積分?jǐn)?shù)升高而逐漸減小，當(dāng)pH 4、油相體積分?jǐn)?shù)為0.8時，乳滴粒徑最小，且分布相對均勻，說明此時乳液最穩(wěn)定；而pH 7～10、油相體積分?jǐn)?shù)為0.8時，乳滴的結(jié)構(gòu)遭到破壞，乳液穩(wěn)定性減弱，這可能是由于大豆分離蛋白與高酯柑橘果膠結(jié)合程度下降，W/O組織結(jié)構(gòu)遭到破壞而導(dǎo)致[33]。

圖9 不同pH值條件下貯存20 d的Pickering乳液微觀形態(tài)（×40）Fig. 9 Microstructure of Pickering emulsion after 20 days of storage under different pH conditions (× 40)

圖10 不同濃度NaCl溶液中貯存的Pickering乳液微觀形態(tài)（×40）Fig. 10 Micromorphology of Pickering emulsion stored in different concentrations of NaCl solution (× 40)

2.6.6 鹽離子穩(wěn)定性分析

Narululla等[34]報道聚丙烯酸-丹尼酸復(fù)合物會在一定NaCl濃度下產(chǎn)生聚集，從而對乳液穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響。不同濃度NaCl溶液處理的Pickering乳液微觀形態(tài)如圖10所示，所有組分均未出現(xiàn)析油現(xiàn)象，說明鹽離子不會破壞大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸構(gòu)成的界面層，油滴被固定在界面層內(nèi)；油相體積分?jǐn)?shù)低于0.6時出現(xiàn)較明顯的析乳情況，且與未添加NaCl溶液相比，添加NaCl溶液的組分析乳情況更明顯，說明鹽離子環(huán)境會降低乳液穩(wěn)定性。

對乳液微觀形態(tài)進(jìn)行觀察，得到隨油相體積分?jǐn)?shù)增加，乳液粒徑逐漸降低，說明增加油相體積分?jǐn)?shù)有利于維持乳液穩(wěn)定性；而與未添加NaCl溶液相比，添加NaCl溶液后的乳液明顯出現(xiàn)聚集，隨NaCl濃度升高，聚集情況逐漸明顯，這可能是由于大豆分離蛋白在鹽溶液中出現(xiàn)輕微鹽析，降低分子間靜電斥力，復(fù)合物結(jié)合的緊密程度下降，乳滴逐漸聚集而導(dǎo)致[33]。因此，鹽離子濃度升高會降低乳液穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

大豆分離蛋白-高酯柑橘果膠-沒食子酸在pH 4.5、溫度35 ℃、沒食子酸含量40 mg時的吸光度為3.082，呈均勻、致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠形成較為緊密的復(fù)合物；油相體積分?jǐn)?shù)為0.7時，G’和G”最大，tanδ最小，乳液形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最強，此時電位為（―54.08±2.74）mV，平均粒徑為（220.36±7.13）nm，乳液穩(wěn)定性相對較強；不同條件下貯存的乳液穩(wěn)定性各不相同，Pickering乳液在25 ℃常溫貯存和4 ℃冷藏相比，4 ℃冷藏條件下析乳現(xiàn)象更弱，油滴粒徑變化更小，不容易出現(xiàn)油滴分布不均的現(xiàn)象，更有利于維持乳液穩(wěn)定性；而在冷凍條件下貯存的乳液隨著油相體積分?jǐn)?shù)升高和冷凍時間的延長液滴粒徑逐漸增大，長期低溫環(huán)境會大大降低乳液穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致乳液質(zhì)量下降。當(dāng)乳液體系pH值接近4時，乳滴粒徑最小，分布相對均勻；高濃度鹽離子會破壞復(fù)合物結(jié)合的緊密程度，液滴發(fā)生聚集，乳液析乳情況明顯，穩(wěn)定性下降。本研究可為蛋白-多糖-多酚復(fù)合物及其Pickering乳液制備提供理論依據(jù)，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。