長鏈非編碼RNA MIR22HG通過微小RNA-9-3p調(diào)節(jié)CTLA4抑制前列腺癌

張 偉, 施春梅, 朱 華, 顧棟華, 潘曉東, 陳新鳳, 鄭 兵

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院/江蘇省南通市第一人民醫(yī)院 泌尿外科, 江蘇 南通, 226000)

前列腺癌是男性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，目前臨床降低其病死率最有效的方法是早期診斷，并在前列腺癌發(fā)生擴(kuò)散之前即進(jìn)行介入治療[1-2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)可以通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制參與腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。其中, LncRNA MIR22HG(簡稱MIR22HG)位于染色體17p13.3, 該染色體區(qū)域在肝癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)為缺失、高甲基化或表現(xiàn)為雜合性缺失[3], 提示MIR22HG的異常表達(dá)可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[4]顯示, MIR22HG通過調(diào)節(jié)微小RNA-9-3p (miR-9-3p)影響骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，此外MIR22HG 作為競爭性內(nèi)源性 RNA發(fā)揮作用，與蛋白質(zhì)、miRNA相互作用參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。MIR22HG可提高免疫治療、靶向治療對癌癥的療效[5]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 (CTLA4)是目前癌癥免疫治療研究領(lǐng)域較為熱門的基因。本研究擬分析MIR22HG/miR-9-3p是否能通過調(diào)節(jié)CTLA-4影響前列腺癌，以期為前列腺癌的免疫治療提供參考，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織、細(xì)胞及動物: 收集本院26例前列腺癌組織樣本和26例前列腺增生組織樣本。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者或家屬了解本研究的內(nèi)容和目的，并簽署知情同意書。人胚腎細(xì)胞HEK293和人前列腺癌細(xì)胞VCAP、PC3、LNCap、DU145均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫。BALB/c裸鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要細(xì)胞、分子和化學(xué)試劑: MEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司; 胎牛血清購自四季青; RNA提取試劑盒購自美國Omega公司; 脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司; Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司; 海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司; 無RNase水和逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購自美國Thermo Fisher公司; SYBR Green熒光定量試劑盒購自美國Bio-rad公司; Western blot相關(guān)試劑購自碧云天; CTLA4兔抗購自美國Abcam公司公司(ab237712); 羊抗兔二抗購自美國Abclonal公司(AS014); ECL顯色液購自美國Millipore公司; 異丙醇等化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán); 戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染: ① 細(xì)胞培養(yǎng)。VCAP細(xì)胞以含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng), PC3細(xì)胞、LNCap細(xì)胞和DU145細(xì)胞均以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。② 細(xì)胞篩選及轉(zhuǎn)染。將處于生長指數(shù)期的VCAP、PC3、LNCap和DU145細(xì)胞以5×104個細(xì)胞/孔接種到12孔板中，采用“1.2.2”項下的方法篩選出MIR22HG及miR-9-3p mRNA表達(dá)較高的細(xì)胞以進(jìn)行下一步研究。按照5×104個細(xì)胞/孔將上述篩選出的細(xì)胞接種到12孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，按照每孔1 mL Opti-MEM培養(yǎng)基、1 μg質(zhì)粒和2 μL Lipofectamine 3000的比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染miR-9-3p及CTLA4, 轉(zhuǎn)染4 h后，吸去12孔板中的轉(zhuǎn)染試劑，并加入新的細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為OE-CTLA4(CTLA4過表達(dá)組)、OE-MIR22HG(MIR22HG過表達(dá)組)、miR-9-3p mimic (miR-9-3p過表達(dá)組)、OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic (MIR22HG及miR-9-3p聯(lián)合過表達(dá)組)、OE-NC+NC mimic(轉(zhuǎn)染對照組)、NC mimic (miR-9-3p過表達(dá)對照組)。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR): 組織及細(xì)胞總RNA提取步驟參考Omega試劑盒的產(chǎn)品說明書。抽提所得的RNA使用Thermo Fisher的Nanodrop 2000儀器進(jìn)行質(zhì)檢，并檢測RNA濃度。根據(jù)濃度計算逆轉(zhuǎn)錄時使用RNA的體積。使用Thermo Fisher的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將1 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序參考Thermo Fisher的產(chǎn)品說明。使用無Rnase水稀釋cDNA 10倍，進(jìn)行qRT-PCR, qRT-PCR擴(kuò)增條件為50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個循環(huán)。MIR22HG引物為: 上游5′-AAGTTGGAGAGCCTTTGCCC-3′; 下游5′-CGCACTATGGTGCCACATCT-3′。miR-9-3p引物：上游5′-GCGGCGGATAAAGCTAGATAAC-3′, 下游5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。CTLA4引物：上游5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′, 下游5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′。內(nèi)參分別為GAPDH(引物：上游5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′, 下游5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′)和U6(引物：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, 下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)。計算并比較前列腺癌組織和正常前列腺增生組織的VCAP細(xì)胞、PC3細(xì)胞、LNCap細(xì)胞與DU145細(xì)胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA相對表達(dá)，所有樣本均重復(fù)3次，取均值。選擇3種前列腺癌細(xì)胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA表達(dá)相對較高者進(jìn)行下一步研究。

1.2.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒? 將PC3細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。人工構(gòu)建miR-9-3p野生型啟動子雙熒光素酶報告基因載體pGL4.10-hRluc，將miR-9-3p預(yù)測結(jié)合位點突變的突變體Mut-miR-9-3p和MIR22HG雙熒光素酶報告基因載體共同轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，吸出培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，收集并裂解細(xì)胞，將生長培養(yǎng)基吸盡, PBS漂洗，加入1×PLB裂解液室溫?fù)u床充分裂解，以熒光素酶底物發(fā)光檢測儀測定熒光信號，重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot): 以RIPA裂解液4 ℃孵育30 min裂解細(xì)胞，將裂解的細(xì)胞移至1.5 mL的EP管, 12 000 g 4 ℃離心15 min, 收集上清液。向上清液加入蛋白上樣緩沖液(loading buffer), 加熱煮沸5 min, 取20 mg的蛋白樣品，以10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 電泳參數(shù)0.3 A、20 V, 轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉封閉60 min, 加入CTLA4兔抗[洗膜緩沖液(TBST)稀釋，工作濃度1∶3 000], 4 ℃孵育過夜, TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗, 25 ℃孵育60 min, TBST洗膜6次, ECL顯色，重復(fù)3次。

1.2.5 前列腺癌異種移植模型的建立: 取裸鼠96只，將經(jīng)不同處理的PC3細(xì)胞制成50 μL含有1×106個/mL細(xì)胞的懸液，即過表達(dá)MIR22HG和miR-9-3p, 合并50 μL Matrigel溶液注射在裸鼠的右腹股溝部，構(gòu)建前列腺癌細(xì)胞的異種移植小鼠模型。將構(gòu)建的小鼠模型分為OE-NC+NC mimic組(對照組)、OE-MIR22HG組(MIR22HG過表達(dá)組)及OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic組(MIR22HG及miR-9-3p過表達(dá)組)，每組32只。以接種細(xì)胞當(dāng)日記為第0天, 自接種第7天開始，每周對8只小鼠進(jìn)行手術(shù)移除原位移植瘤，并統(tǒng)計瘤體的體質(zhì)量和體積變化，共檢測4周。腫瘤體積的計算公式為:V=0.8×2/3×D1×D2 (D1、D2分別為相互垂直的最長直徑與短直徑)。小鼠采用靜脈注釋3倍濃度的3%戊巴比妥鈉實行安樂死。本實驗已得到本院動物倫理會的批準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌組織及細(xì)胞MIR22HG和

miR-9-3p mRNA相對表達(dá)

與前列腺增生組織相比，前列腺癌組織中MIR22HG mRNA降低, miR-9-3p mRNA增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。前列腺癌細(xì)胞VCAP、PC3、LNCap和DU145細(xì)胞中, PC3細(xì)胞MIR22HG mRNA相對較低, miR-9-3p mRNA相對較高(P<0.05), 因此選擇PC3細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。見圖1。

A: qRT-PCR檢測前列腺癌組織中MIR22HG的表達(dá)(與前列腺增生組織比較, *P<0.05); B: qRT-PCR檢測前列腺癌組織中miR-9-3p的表達(dá)(與前列腺增生組織比較, *P<0.05); C: qRT-PCR檢測前列腺癌細(xì)胞中MIR22HG和miR-9-3p的表達(dá)(與VCAP相比, *P<0.05); D: qRT-PCR檢測前列腺癌組織、前列腺癌細(xì)胞中MIR22HG和miR-9-3p的表達(dá)(1: 前列腺癌組織; 2: 正常前列腺增生組織; 3: VCAP; 4: PC3; 5: LNCap; 6: DU145)。圖1 前列腺癌組織及細(xì)胞的MIR22HG和miR-9-3p mRNA相對表達(dá)

2.2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表達(dá)

通過TargetScan網(wǎng)站(http://www.TargetScan.org)預(yù)測MIR22HG和miR-9-3p的靶向關(guān)系。在PC3細(xì)胞中成功過表達(dá)MIR22HG, 通過熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了MIR22HG和miR-9-3p的靶向抑制關(guān)系。過表達(dá)MIR22HG, miR-9-3p表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05), 結(jié)果表明MIR22HG可以靶向結(jié)合miR-9-3p, 并抑制其表達(dá)。見圖2。

A: MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用位點; B: qRT-PCR檢測MIR22HG的過表達(dá)效率(與OE-NC比較, *P<0.05); C: 熒光素酶報告實驗檢測MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用(與OE-NC比較, *P<0.05); D: qRT-PCR檢測過表達(dá)MIR22HG后, miR-9-3p的表達(dá)(與OE-NC比較, *P<0.05)。圖2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表達(dá)

2.3 MIR22HG通過抑制miR-9-3p調(diào)控免疫基因CTLA4

TargetScan數(shù)據(jù)庫(http://www.TargetScan.org/)預(yù)測免疫基因CTLA4與miR-9-3p的靶向關(guān)系。在PC3細(xì)胞中成功過表達(dá)CTLA4, 通過熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9-3p與CTLA4的靶向抑制關(guān)系。過表達(dá)miR-9-3p,CTLA4表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05), 結(jié)果表明miR-9-3p可能靶向激活CLTA4的表達(dá)。見圖3。

A: miR-9-3p和CTLA4的靶向作用位點; B: qRT-PCR檢測過表達(dá)CTLA4后, CTLA4 mRNA表達(dá)(與OE-NC比較, *P<0.05); C: Western blot檢測過表達(dá)CTLA4后, CTLA4蛋白表達(dá)(與OE-NC比較, *P<0.05); D: qRT-PCR檢測過表達(dá)miR-9-3p后, CTLA4 mRNA表達(dá)(與NC mimic比較, *P<0.05); E: Western blot檢測過表達(dá)miR-9-3p后, CTLA4蛋白表達(dá)(與NC mimic比較, *P<0.05); F: 熒光素酶報告實驗檢測miR-9-3p和CTLA4的靶向作用(與NC mimic比較, *P<0.05); G: qRT-PCR檢測過表達(dá)MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表達(dá)情況(與OE-NC+NC mimic比較, *P<0.05); H: Western blot檢測過表達(dá)MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表達(dá)情況(與OE-NC+NC mimic比較, *P<0.05)。圖3 MIR22HG通過抑制miR-9-3p調(diào)控免疫基因CTLA4

2.4 MIR22HG負(fù)調(diào)控CTLA4抑制前列腺癌細(xì)胞

與OE-NC+NC mimic組比較, OE-MIR22HG組裸鼠皮下腫瘤的質(zhì)量和體積均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic組裸鼠皮下腫瘤的質(zhì)量和體積與OE-NC+NC mimic組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

3 討 論

在過去10年中，各種實體瘤的免疫治療實驗數(shù)量大幅增加，癌癥免疫治療取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，越來越多的癌癥預(yù)后預(yù)測因子被鑒定并驗證[6-7]。手術(shù)后化療和/或放療仍然是許多實體瘤的主要治療方法，但免疫治療正在迅速與其他療法結(jié)合，可改善患者生存率。免疫治療在前列腺癌中的治療效果有較高提升空間[8]。研究[9]表明，炎癥在前列腺癌的生長和轉(zhuǎn)移不同階段起著重要作用。從前列腺炎癥發(fā)作開始，各種信號通路在耐藥性和免疫抑制的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10-11]。

A: 皮下腫瘤質(zhì)量(與OE-NC+NC mimic組比較, *P<0.05; 與OE-MIR22HG組比較, #P<0.05);B: 皮下腫瘤體積(與OE-NC+NC mimic組比較, *P<0.05; 與OE-MIR22HG組比較, #P<0.05)。

本研究結(jié)果顯示，前列腺癌的MIR22HG呈低表達(dá), miR-9-3p呈高表達(dá)。研究[12]顯示, MIR22HG在結(jié)直腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、肺癌和甲狀腺癌等惡性腫瘤組織呈低表達(dá)，其作為競爭性內(nèi)源性RNA (ceRNA)參與信號通路，與蛋白質(zhì)相互作用參與腫瘤進(jìn)展, MIR22HG低表達(dá)的癌癥患者預(yù)后較差。miR-9-3p在甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤組織呈高表達(dá)，下調(diào)miR-9-3p可逆轉(zhuǎn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而降低甲狀腺乳頭狀癌的侵襲和遷移活性，提示miR-9-3p具有促癌作用[13]。本研究通過TargetScan網(wǎng)站及熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證了MIR22HG與miR-9-3p的靶向抑制關(guān)系，與相關(guān)研究[14]中MIR22HG通過靶向調(diào)節(jié)miR-9-3p表達(dá)影響喉癌進(jìn)展的結(jié)果相一致。

TargetScan數(shù)據(jù)庫及熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9-3p與CTLA4存在靶向抑制關(guān)系，過表達(dá)miR-9-3p的CTLA4的表達(dá)也顯著上調(diào)，表明miR-9-3p可以靶向激活CLTA4的表達(dá)。CLTA4是活化T細(xì)胞表面表達(dá)的膜蛋白，對T細(xì)胞增生起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，在自身免疫性疾病的發(fā)病中具有重要作用。CLTA4已被廣泛應(yīng)用于免疫治療惡性腫瘤，如伊匹單抗通過作用于CTLA-4達(dá)到免疫治療前列腺癌的目的。本研究進(jìn)一步通過裸鼠研究證實了上述論點，即分別構(gòu)建過表達(dá)MIR22HG及過表達(dá)MIR22HG和miR-9-3p的前列腺癌細(xì)胞的異種移植小鼠，動態(tài)檢測接種后1～4周瘤體的質(zhì)量、體積變化，結(jié)果顯示, OE-MIR22HG組裸鼠皮下腫瘤的質(zhì)量和體積均顯著減小, MIR22HG及miR-9-3p聯(lián)合過表達(dá)組裸鼠皮下腫瘤的質(zhì)量和體積與OE-NC+NC mimic差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示MIR22HG的抑癌作用可被過度表達(dá)的miR-9-3p抑制。但本研究存在不足，盡管本研究TargetScan數(shù)據(jù)庫及熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9-3p與CTLA4存在靶向抑制關(guān)系，但miR-9-3p與CTLA4的關(guān)系鮮有文獻(xiàn)報道支持，本研究也未進(jìn)行CTLA4細(xì)胞轉(zhuǎn)染裸鼠的在體研究驗證，因此未來還需進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述, MIR22HG與miR-9-3p存在靶向負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系, miR-9-3p與CTLA4存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系, MIR22HG/miR-9-3p可能通過抑制CTLA4達(dá)到免疫治療前列腺癌的目的。