富含ω-3多不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸制備工藝研究

廖妙飛，付萬冬，孫繼鵬，周宇芳，馬明珠，王家星，姚瑋，胡詩琦

(浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021)

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)又稱絲氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸絲氨酸，存在于動物、高等植物及微生物的生物膜中。PS能夠調(diào)節(jié)腦內(nèi)情緒神經(jīng)傳輸遞質(zhì)的激素水平，同時可以抑制血清中促腎上腺皮質(zhì)激素和可的松等的水平，對抑郁癥病人的情緒紊亂、行為異常、焦慮及易怒等癥狀具有明顯的改善效果[1-2]，以及對因為腦營養(yǎng)不良、腦部損傷或遺傳性神經(jīng)遞質(zhì)數(shù)量下降所造成的小兒多動癥也有著優(yōu)越的改善效果[3-5]。通過工藝研究可制備磷脂含量較高的南極磷蝦油[6]，且磷脂主要為磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)[7]，PC在總磷脂中的占比最高可達(dá)99.80%，而其中ω-3多不飽和脂肪酸(EPA、DHA)主要以磷脂形式存在即EPA/DHA型磷脂[8-9]。眾所周知，EPA、DHA作為特定的免疫營養(yǎng)素，具有抗氧化、抗炎、降低血糖及增加機(jī)體對胰島素的敏感性等作用。而且DHA 與PS在輔助改善記憶力和增強(qiáng)免疫能力功能方面存在相互配伍[10]。

目前商品化的PS主要從大豆中提取，常用的分離方法有吸附分離法、低級醇分離法、CO2超臨界萃取法及膜分離法等。近年來，通過酶改性法制備得到的PS產(chǎn)品越來越多，磷脂酶D能催化甘油C-3位頭部末端的磷酸酯鍵，并在一定條件下催化磷脂酰殘基與絲氨酸結(jié)合生成PS的單一磷脂產(chǎn)品。通過酶法改性獲得的PS具有反應(yīng)條件溫和、速度快、副產(chǎn)物少、酶制劑作用部位準(zhǔn)確等特點。2010年，中國將PS列入新資源食品名單，其原料就是大豆卵磷脂和L-絲氨酸，采用磷脂酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，純化濃縮，再經(jīng)過二次純化，干燥后包裝制得[11]。本文以南極磷蝦油為原料，利用其中富含的EPA、DHA型磷脂，在磷脂酶D的作用下與L-絲氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，制得富含ω-3多不飽和脂肪酸的PS，即EPA/DHA型PS，并通過單因素和正交試驗得到最佳制備工藝條件，可進(jìn)一步拓展南極磷蝦油的深加工利用技術(shù)，提高其附加值，為營養(yǎng)健康食品高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)作貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷脂酶D(上海源葉生物科技有限公司)；南極磷蝦油(PC含量為60%，遼漁集團(tuán)有限公司)；PS標(biāo)準(zhǔn)品(99%以上，Sigma-Aldrich)；PC標(biāo)準(zhǔn)品(98%以上，Sigma-Aldrich)；甲醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；異丙醇(色譜純，異丙醇)；正己烷(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；L-絲氨酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；CaCl2(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、無水乙酸鈉(西隴科學(xué)股份有限公司)、乙酸乙酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、丙酮(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、乙醚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、pH計、Agilent 8860氣相色譜儀等。

1.3 方法

1.3.1 PS的制備工藝流程

一定量的南極磷蝦油溶解于有機(jī)溶劑并將其作為有機(jī)相，將酶、絲氨酸溶解于緩沖溶液，并在緩沖溶液中加入一定量的CaCl2，以此作為水相，兩相分別預(yù)熱后混合，放入振蕩培養(yǎng)箱，于一定溫度下振蕩反應(yīng)一定時間后，加入1 mol/L鹽酸將酶滅活；將反應(yīng)混合物靜置，分離兩相，取有機(jī)相，加入2.5倍體積的氯仿，混勻后，靜置分層，取氯仿層進(jìn)行減壓蒸餾，除去氯仿，得到富含ω-3多不飽和脂肪酸的PS產(chǎn)物。

1.3.2 PS檢測方法

采用Agilent 1260 高效液相色譜儀測定PS和PC。色譜條件：色譜柱為ZORBAX RX -SIL Columns(4.6 mm×250 mm)；以甲醇-水-冰醋酸(體積比79∶14∶0.23)為流動相A，以異丙醇-正己烷-流動相A(體積比45∶20∶27)為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為37°C，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測(條件：漂移管溫度60°C，載氣流量1.8 mL/min)，洗脫程序如表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient eluted program

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將PS標(biāo)準(zhǔn)品溶解于氯仿/乙腈(體積比為7∶2)，配制成濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22 μm濾膜過濾后，按照上述方法進(jìn)行HPLC分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

待測樣品中PS的定量分析：將待測樣品處理后，按照同樣的分析條件進(jìn)行HPLC分析，從色譜圖中求得峰面積，根據(jù)PS標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算進(jìn)樣濃度，從而計算待測樣品中PS的總質(zhì)量。

式中，0.6表示南極磷蝦油中PC含量以60%計。

1.3.3 EPA、DHA檢測方法

參照GB/T 38095—2019《DHA、EPA含量測定——氣相色譜法》。

1.3.4 單因素試驗

按照PS的制備方法，設(shè)置3個重復(fù)水平的試驗，以PS得率為考察指標(biāo)，以南極磷蝦油濃度10 mg/mL、絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比6∶1、PLD添加量為55 U、反應(yīng)溫度40℃為基礎(chǔ)，分別考察了有機(jī)相種類(正己烷、乙酸乙酯、乙醚)、反應(yīng)溫度(35、40、45、50、55℃)、水相pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、有機(jī)相和水相體積比(0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1)、絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比(2∶1、4∶1、8∶1、16∶1、24∶1、32∶1)，以及反應(yīng)時間(1、2、4、6、8、10、12 h)等因素對 PS 得率的影響。

1.3.5 正交試驗

在1.3.4單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗L9(34)，并進(jìn)行3個重復(fù)水平的試驗，根據(jù)試驗結(jié)果得出PS制備的最佳工藝條件。

表2 正交試驗因素水平表Tab.2 The factor level of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對PS得率的影響

2.1.1 有機(jī)相種類

本研究采用有機(jī)相與水相兩相體系，以極性為指標(biāo)，選取具有代表性的有機(jī)溶劑乙酸乙酯、正己烷、乙醚，與醋酸緩沖液混合形成兩相反應(yīng)體系，表3為使用不同有機(jī)溶劑時PS的得率。由表3可知，當(dāng)使用乙酸乙酯時，PS的得率最高；當(dāng)使用正己烷時，兩相體系幾乎無反應(yīng)；當(dāng)使用乙醚時，PS得率較乙酸乙酯次之。綜合PS得率、有機(jī)溶劑沸點及毒性，優(yōu)選乙酸乙酯作為本研究的有機(jī)溶劑。

表3 使用不同有機(jī)溶劑時PS的得率Tab.3 PS yield at different organic solvent

2.1.2 反應(yīng)溫度

在一定的溫度范圍內(nèi)，酶活隨反應(yīng)溫度的遞增一般呈現(xiàn)先增加后減小的變化，酶活力最高點為其最適反應(yīng)溫度。由圖1可以看出，在35～55℃ 的溫度范圍內(nèi)，PS的最終得率相差不大，但觀察各溫度下PS得率隨時間變化的曲線可以看出，在 40℃下PS前4 h合成的速度最快，但與45℃反應(yīng)溫度下到達(dá)反應(yīng)平衡狀態(tài)的時間差別不大。在考慮能耗的情況下，在本試驗研究條件中磷脂酶D催化合成 PS 的最適反應(yīng)溫度為40℃左右。

2.1.3 水相pH值

水相pH值對PS得率的影響，主要是通過影響酶活性部位基團(tuán)離子化程度和三維結(jié)構(gòu)的共價鍵發(fā)揮作用。在反應(yīng)體系中，酶具有催化底物磷脂進(jìn)行兩種酶促反應(yīng)的活性：一種是磷脂的水解，產(chǎn)生磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)；另一種是磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成PS。不同pH值對PS得率的影響如圖2所示，當(dāng)pH在3.5～5.5之間時，PS得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；當(dāng) pH為4.5時，PS 的得率達(dá)到最大，說明此時酶的轉(zhuǎn)酯活性達(dá)到最大。

2.1.4 有機(jī)相與水相體積比

兩相體積比對PS得率的影響如圖3所示。兩相反應(yīng)體系中，PS得率隨著有機(jī)相與水相體積比的增大呈現(xiàn)先增加后減少趨勢；當(dāng)兩相體積比小于1∶1時，隨著有機(jī)相體積比例的增加，酶與磷脂接觸幾率增大，PS得率增加；當(dāng)兩相體積比達(dá)到1∶1時，PS得率達(dá)到最大；隨著有機(jī)相比例繼續(xù)增大，PS得率開始下降，這可能是由過高的有機(jī)相比例影響磷脂酶的活性導(dǎo)致的。

2.1.5 絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比

絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比對PS得率的影響如圖4所示。由圖4可知，在絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比小于16∶1時，PS得率隨著絲氨酸含量的增加而增大，這是因為此時作為底物的絲氨酸的含量的增加對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的發(fā)生具有促進(jìn)作用；當(dāng)兩者質(zhì)量比達(dá)到16∶1時，PS得率達(dá)到最大值，且再提高絲氨酸比例也不再變化，說明此時南極磷蝦油中磷脂與酶形成的復(fù)合物已經(jīng)全部被絲氨酸飽和。因此，絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比選擇16∶1為宜。

2.1.6 反應(yīng)時間

反應(yīng)時間對PS得率的影響如圖5所示。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，PS得率迅速增加，隨后趨于平緩；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行8 h后，PS得率基本不再變化，說明此時底物轉(zhuǎn)酯反應(yīng)基本停止。因此試驗反應(yīng)時間選擇8 h為宜。

2.2 正交試驗結(jié)果

由單因素結(jié)果可知，水相pH值、反應(yīng)溫度、有機(jī)相與水相的體積比、反應(yīng)時間對PS得率有較大的影響，因此選擇這4個因素設(shè)計正交試驗，結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗結(jié)果Tab.4 The orthogonal test results

由表4中極差R值可知，各因素對PS得率的影響大小為水相pH值>反應(yīng)時間>有機(jī)相與水相的體積比>反應(yīng)溫度，但方差分析顯示，4個因素對制備PS得率的影響均不顯著(表5)。本試驗結(jié)果以PS得率為指標(biāo)，數(shù)值越大越理想，比較表4中4個因素的K1、K2、K3大小，K值最大對應(yīng)的水平即為最佳水平，因此最佳因素水平組合為A2B2C2D2，即pH 4.5、反應(yīng)溫度40℃、有機(jī)相與水相的體積比1∶1、反應(yīng)時間8 h。因此，制備PS的最佳工藝條件為水相pH 4.5、有機(jī)相水相體積比1∶1、反應(yīng)溫度40℃、加酶量55 U、絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比16∶1、反應(yīng)時間8 h。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗，PS得率均值為85.62%(標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.16)，產(chǎn)物中EPA含量為24.33%(標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.13)，DHA含量為19.95%(標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.12)。

表5 方差分析表Tab.5 Variance analysis

3 討論

PS作為一種新資源食品，其制備工藝的研究引起較多相關(guān)人員的重視，且大多是以大豆磷脂和L-絲氨酸為底物，開展兩相體系中酶法制備及純化工藝的研究[12-14]，如朱世斌[15]以蛋黃卵磷脂為底物開展酶法制備研究、王煥[16]以椰子油替代兩相反應(yīng)體系中的有機(jī)溶劑開展相關(guān)研究；總體來說，PS的制備過程中兩相反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑種類、pH值、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、有機(jī)相與水相的體積比、物料質(zhì)量比等因素對得率均有較大的影響。也有研究人員嘗試其他制備工藝，如秦鑫鑫等[17]等以超臨界CO2為非水反應(yīng)介質(zhì)，利用磷脂酶A1和磷脂酶D催化制備富含DHA的南極磷蝦PS，但此研究有兩步催化反應(yīng)，工藝較為復(fù)雜，且需要超臨界設(shè)備才能實現(xiàn)；杜陽吉[18]則是開展單一水相法催化合成PS的工藝研究，在單一水相中，磷脂酶有很高的水解活性而轉(zhuǎn)酯活性較低，導(dǎo)致最終反應(yīng)體系中PS的含量僅為15.78%。

本研究中，在有機(jī)溶劑種類選擇方面，由表3數(shù)據(jù)可以看出：不同極性有機(jī)溶劑作用下PS的得率有所不同，這可能是由于有機(jī)溶劑極性影響兩相中底物與產(chǎn)物的分配與擴(kuò)散，從而使反應(yīng)的平衡常數(shù)和速率常數(shù)發(fā)生變化；其次，不同極性的有機(jī)溶劑與酶接觸后，對維持酶蛋白活性構(gòu)型的氫鍵、疏水鍵的影響不同，從而導(dǎo)致PS得率有所不同。一方面，乙酸乙酯、乙醚、正己烷三種有機(jī)溶劑的極性依次減小，溶劑極性越小，疏水性越強(qiáng)，雖然南極磷蝦油磷脂在正己烷中有較大的溶解度，但正己烷強(qiáng)大的疏水性使其很難進(jìn)入磷脂酶D的必需水層進(jìn)行反應(yīng)。另一方面，溶劑極性越強(qiáng)，越容易奪取酶分子的結(jié)合水，對酶活力的影響越大，因此乙酸乙酯對酶活力的影響大于乙醚和正己烷。在這兩方面影響的共同作用下，對比表3數(shù)據(jù)可知，以正己烷為有機(jī)溶劑的兩相反應(yīng)體系的PS得率最低。

磷脂酶D的最適溫度和pH值受其來源影響較大，大多數(shù)最適催化溫度為25～45℃；微生物來源的磷脂酶D最適 pH 在4～8之間，植物來源的在5～6之間。本試驗中磷脂酶D的最適溫度為40℃、pH為4.5，在此條件下兩相體系中轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和水解反應(yīng)同時進(jìn)行，水解反應(yīng)副產(chǎn)物 PA會影響目標(biāo)產(chǎn)物 PS 的生成，此時兩相體積比、底物質(zhì)量比顯得尤為重要。兩相體積比主要是對水相中的酶與有機(jī)相中底物的接觸概率產(chǎn)生影響，有機(jī)相與水相體積比的增加提高了PS得率，當(dāng)體積比繼續(xù)增大時，雖然底物和磷脂酶 D 的接觸概率提高，但酶更容易與有機(jī)溶劑接觸而使活性降低，因此 PS 得率逐漸下降。底物質(zhì)量比則是通過影響反應(yīng)的化學(xué)平衡及與酶的配比，從而影響反應(yīng)結(jié)果。當(dāng)絲氨酸與酶同處于水相時，作為親核試劑的絲氨酸首先進(jìn)入酶活性中心，絲氨酸比例的增加形成了更多的絲氨酸-酶復(fù)合物，從而提高了PS得率，當(dāng)絲氨酸達(dá)到一定量后，酶活性中心全部被絲氨酸飽和，PS得率達(dá)到最大值。

本研究通過單因素和正交試驗，獲得富含ω-3多不飽和脂肪酸的PS最佳制備工藝條件：水相pH 4.5、有機(jī)相和水相體積比1∶1、反應(yīng)溫度40℃、加酶量55 U、L-絲氨酸與南極磷蝦油質(zhì)量比16∶1、反應(yīng)時間8 h，在此條件下，PS得率為85.62%，其中EPA含量為24.33%，DHA含量為19.95%。