兔部分損傷前交叉與內(nèi)側(cè)副韌帶差異環(huán)狀RNA的篩選與功能分析*

陳思遠(yuǎn) 谷慧凝 韓銀河 張明正 李 彬 溫 昱△

（中國醫(yī)科大學(xué)，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽 110122；2 附屬盛京醫(yī)院關(guān)節(jié)外科與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，沈陽 110022）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要裝置，其運(yùn)動(dòng)損傷多見，好發(fā)于競技體育運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目[1]。反復(fù)扭傷后，易引起多種并發(fā)癥，導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)水平大幅下降[2]。ACL損傷內(nèi)源性恢復(fù)難度大，且有一定的復(fù)發(fā)率[3]，手術(shù)治療后常需二次翻修[4]。相比ACL，內(nèi)側(cè)副韌帶（medial collateral ligament，MCL）具有更好的自愈能力[5-6]。近期研究表明，雖然ACL也存在一定的自愈能力[6]，但與MCL相比，兩者之間自愈能力差異的原因仍有待探究。

環(huán)狀RNA是通過反向剪接形成的非編碼RNA[7]，具有參與調(diào)節(jié)ceRNA網(wǎng)絡(luò)等功能[8]，廣泛參與機(jī)體的各種生理過程[9]，目前環(huán)狀RNA在腫瘤[10]以及心肺疾病[11]中的研究較為深入，對(duì)環(huán)狀RNA的深入研究更全面地揭示了相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，但環(huán)狀RNA在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病中的研究仍不充分。本研究交叉探討正常與部分損傷的ACL及MCL之間的環(huán)狀RNA表達(dá)差異及其功能，旨在從轉(zhuǎn)錄組水平探尋ACL內(nèi)源性修復(fù)障礙的可能原因，并為生物治療新技術(shù)提供思路，拓展ACL與MCL的分子解剖學(xué)版圖。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡健康雄性新西蘭大白兔6只，體質(zhì)量2.5~3.0 kg，購自青島康達(dá)生物科技有限公司（中國青島）。實(shí)驗(yàn)兔在中國醫(yī)科大學(xué)（中國沈陽）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系飼養(yǎng)，溫度23 ℃±2 ℃，12 h光暗循環(huán)。中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)于2020年10月22日批準(zhǔn)該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（批準(zhǔn)號(hào)CMU2020310）。

1.2 主要試劑

TRIzol試 劑（Life Technologies公 司）；Ribo-Zero? Magnetic Kit（Epicentre公司）；Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit （NEB公司）；RNA clean beads（諾唯贊公司）；DNA clean beads（諾唯贊公司）；QIAquick?Gel Extraction kit（QIAGEN）；PCR引物（生工生物工程公司）；瓊脂糖（Biorad）；PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Takara Bio公司）；SYBR Premix ex TaqⅡ （Takara Bio公司）；PCR引物均購自生工生物公司。

1.3 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

6只3月齡健康雄性新西蘭大白兔隨機(jī)選取3只作為對(duì)照組，對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)，不損傷ACL、MCL；損傷組使用0.9 mm針頭對(duì)其余三只兔雙腿ACL、MCL均于股骨近端1/3處橫向穿刺，隨后撕裂，導(dǎo)致大部分（約 2/3）韌帶鈍性撕列。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在造模后1周同時(shí)取材。取材前，將兔經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖并分離兔ACL、MCL，韌帶迅速置于液氮中凍存。具體手術(shù)及取材過程如前述[12]。在ACL、MCL正常組與損傷組中各隨機(jī)選取2個(gè)樣本進(jìn)行測序，其余樣本留存進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。

1.4 環(huán)狀RNA建庫與測序

先 使 用TRIzol試 劑 從ACL及MCL組 織 中分別提取每個(gè)樣本的總RNA，使用RiboZeroTMMagnetic Beads以及Ribo-ZeroTMMagnetic Gold Kit （Human/Mouse/Rat）去除rRNA，并去除樣本中的線性RNA，打斷rRNA-depleted RNA，利用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)cDNA并純化，并進(jìn)行cDNA末端修復(fù)連接接頭，篩選片段進(jìn)行USER 酶消化和 PCR 擴(kuò)增，使用瓊脂糖電泳進(jìn)行核酸回收，質(zhì)檢合成后利用Novaseq6000進(jìn)行測序。以P＜0.05且差異表達(dá)倍數(shù)≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選各組差異環(huán)狀RNA，選擇各組上、下調(diào)前五的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

1.5 qRT-PCR驗(yàn)證

使用TRIzol試劑從韌帶組織中提取每個(gè)樣本的 總RNA。使 用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Premix ex TaqⅡ試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR檢測。采用β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，所用引物序列見表1。為了定量分析差異表達(dá)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法處理，所有環(huán)狀RNA的表達(dá)均為β-actin的相對(duì)倍數(shù)變化，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.6 差異表達(dá)環(huán)狀RNA生物信息學(xué)分析

基于以下數(shù)據(jù)庫對(duì)基因功能進(jìn)行注釋：京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫；基因本體論（Gene Ontology，GO）。使用topGOR軟件包進(jìn)行GO富集分析，并使用Kobas軟件檢測KEGG通路的富集。根據(jù)GO富集分析與KEGG估計(jì)分析結(jié)果，將ACL損傷后與MCL損傷后的兩組差異環(huán)狀RNA進(jìn)行對(duì)比。

1.7 差異環(huán)狀RNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過以下條件篩選可信的ceRNA關(guān)系對(duì)。①ceRNA之間相同的miRNA數(shù)量應(yīng)大于5。②超幾何檢驗(yàn)的P值小于0.01，校正后的FDR值小于0.01。③共表達(dá)分析結(jié)果指向一個(gè)ceRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，其中2個(gè)ceRNA彼此共表達(dá)。基于ceRNA網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件提取各差異組合的關(guān)系對(duì)。利用CytoHubba插件鑒定每組前10個(gè)節(jié)點(diǎn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以±s表示。采用GraphpadPrism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。P值＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)狀RNA原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將新西蘭大白兔分為正常組與損傷組，隨機(jī)選取8個(gè)樣本對(duì)其環(huán)狀RNA表達(dá)譜進(jìn)行全面測序。將進(jìn)行質(zhì)量控制與質(zhì)量評(píng)估后的8個(gè)樣本的測序結(jié)果與新西蘭大白兔基因組樣本進(jìn)行對(duì)比，得到測序數(shù)據(jù)在指定基因組上的位置并使用軟件CIRI進(jìn)行環(huán)狀RNA預(yù)測。以FC＞2且P＜0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選出4種對(duì)比組之間的差異環(huán)狀RNA。分析環(huán)狀RNA在兩組樣品間的表達(dá)水平差異程度及其假設(shè)檢驗(yàn)，結(jié)果表明篩選出的各組差異circRNA 滿足篩選條件。對(duì)篩選出的環(huán)狀RNA做層次聚類分析，結(jié)果表明同一總體不同樣本中的環(huán)狀RNA表達(dá)略有差異，但總體表達(dá)趨勢相近，符合邏輯。各組共篩選出308個(gè)差異環(huán)狀RNA，其中123個(gè)上調(diào)，185個(gè)下調(diào)（表2）。

表1 引物序列

表2 各對(duì)比組差異表達(dá)環(huán)狀RNA數(shù)量

2.2 差異表達(dá)環(huán)狀RNA驗(yàn)證

對(duì)篩選出的差異表達(dá)環(huán)狀RNA進(jìn)一步進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)差異，分別選擇了4個(gè)對(duì)比組中的前5個(gè)上調(diào)與前5個(gè)下調(diào)環(huán)狀RNA進(jìn)行驗(yàn)證，此40個(gè)環(huán)狀RNA的qRT-PCR表達(dá)趨勢均與測序結(jié)果相一致（圖1）。

圖1 各差異表達(dá)環(huán)狀RNA在兩種樣本中的表達(dá)量差異

2.3 差異表達(dá)環(huán)狀RNA GO分析

繪制差異環(huán)狀RNA來源基因GO分析柱狀統(tǒng)計(jì)圖（圖2）。分析各2級(jí)分類下所有環(huán)狀RNA與各組差異環(huán)狀RNA的不同富集趨勢，各組總環(huán)狀RNA與差異環(huán)狀RNA均富集于細(xì)胞進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞匯集以及催化活性能。

在ACL正常樣本與損傷樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在組織或生物體的細(xì)胞組成部分、遷移、超分子復(fù)合體、信號(hào)傳感器活動(dòng)、分子傳感器活動(dòng)（以及細(xì)胞連接功能方面表現(xiàn)出較總環(huán)狀RNA更高的富集水平。

在MCL正常樣本與損傷樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在細(xì)胞殺傷、病毒體、病毒體組分、信號(hào)傳感器活動(dòng)（以及分子傳感器活動(dòng)功能方面表現(xiàn)出較總環(huán)狀RNA更高的富集水平。

在MCL正常樣本與ACL正常樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在細(xì)胞行為、生長、突觸、擬核、信號(hào)傳感器活動(dòng)以及分子傳感器活動(dòng)功能方面表現(xiàn)出較總環(huán)狀RNA更高的富集水平。

在MCL損傷樣本與ACL損傷樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在免疫系統(tǒng)進(jìn)程、生長、病毒體、病毒體組分、分子功能調(diào)節(jié)器以及轉(zhuǎn)錄因子活動(dòng)與蛋白結(jié)合功能方面表現(xiàn)出較總環(huán)狀RNA更高的富集水平。

2.4 差異表達(dá)環(huán)狀RNA KEGG分析

進(jìn)一步運(yùn)用Cluster Profiler分析差異表達(dá)環(huán)狀RNA來源基因在KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫中各通路的富集情況（圖3）。

通過KEGG分析，在ACL正常樣本與損傷樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在人類巨細(xì)胞病毒感染及抗原加工與呈遞通路中富集程度最為顯著。差異環(huán)狀RNA在內(nèi)吞作用及RNA降解通路中數(shù)量最多。

在MCL正常樣本與損傷樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在NF-κB信號(hào)通路及人類巨細(xì)胞病毒感染通路中富集程度最為顯著，也在此兩者通路中數(shù)量最多。

在MCL正常樣本與ACL正常樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在JAK-STAT 信號(hào)通路中富集程度最為顯著，也在此通路中數(shù)量最多，且可信度也最高。

圖2 差異表達(dá)環(huán)狀RNA GO分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為GO分類，縱坐標(biāo)左側(cè)為基因數(shù)目所占百分比，右側(cè)為基因數(shù)目。深色柱代表差異環(huán)狀RNA基因，淺色柱代表所有環(huán)狀RNA。A： ACL正常組vs ACL損傷組；B： MCL正常組vs MCL損傷組；C： MCL正常組vs ACL正常組；D： MCL損傷組vs ACL損傷組.圖3 差異表達(dá)環(huán)狀RNA KEGG分析結(jié)果。圖中每一個(gè)圓表示一個(gè)KEGG通路，縱坐標(biāo)為通路名稱，橫坐標(biāo)為差異環(huán)狀RNA的富集因子，即差異環(huán)狀RNA中注釋到該通路的基因比例與所有環(huán)狀RNA中注釋到該通路的基因比例的比值。圓圈的顏色代表P value。圓圈的大小代表環(huán)狀RNA數(shù)目。A： ACL正常組vs ACL損傷組；B： MCL正常組vs MCL損傷組；C： MCL正常組vs ACL正常組；D： MCL損傷組vs ACL損傷組.

在MCL損傷樣本與ACL損傷樣本對(duì)比組中，差異環(huán)狀RNA在胰腺分泌及胰腺腫瘤通路中富集程度最為顯著。差異環(huán)狀RNA在內(nèi)吞作用通路中數(shù)量最多。

2.5 差異表達(dá)環(huán)狀RNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

圖4 差異表達(dá)環(huán)狀RNA-miRNA-mRNA網(wǎng)格

環(huán)狀RNA作為ceRNA網(wǎng)絡(luò)的重要組成成分，可以與miRNA結(jié)合，減弱其對(duì)mRNA翻譯蛋白的抑制作用。分析各組差異circRNA的下游miRNA與靶基因，利用Cytoscape軟件繪制網(wǎng)絡(luò)，并利用cytoHubba軟件中的MCC算法篩選出各組網(wǎng)絡(luò)圖中相關(guān)度最高的前10位基因，繪制網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。

3 討論

ACL與MCL損傷后兩組差異環(huán) 狀RNA來 源基因富集通路的不同點(diǎn)主要集中在4個(gè)方面。①在損傷組織的修復(fù)過程中需要生成新的血管[11]，并募集巨噬細(xì)胞[13]，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。在GO分析中，ACL損傷后主要富集于抑制血管生成相關(guān)通路，總量達(dá)到促進(jìn)血管生成相關(guān)通路的2倍多。MCL損傷后則無抑制血管生成相關(guān)通路的富集。②修復(fù)性炎癥可以清除壞死組織，為組織修復(fù)重建創(chuàng)造有利環(huán)境，但過度的炎癥反應(yīng)會(huì)引起纖維化，出現(xiàn)修復(fù)缺陷[14，15]。ACL與MCL的差異環(huán)狀RNA可能從不同途徑參與了炎癥反應(yīng)。KEGG分析結(jié)果顯示，ACL損傷后約1/3通路與炎癥相關(guān)，而MCL則不到1/6，且二者僅有一條相同的富集通路，存在較大差異。有證據(jù)表明，ACL損傷后炎癥反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致了愈合障礙及骨關(guān)節(jié)炎[16]，而相關(guān)環(huán)狀RNA的表達(dá)差異可能為其原因之一。③組織損傷后，多種細(xì)胞被募集參與修復(fù)過程[17，18]。GO分析結(jié)果顯示，兩組均不同程度的富集于促進(jìn)細(xì)胞增殖的通路中，ACL有11條通路，MCL有14條相關(guān)富集通路。ACL損傷后也有部分富集于4條細(xì)胞周期阻滯通路中，而MCL沒有，這些環(huán)狀RNA的功能以及其是否能作為ACL內(nèi)源性修復(fù)障礙的因素之一仍有待探究。④在mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白翻譯KEGG相關(guān)通路中，兩組均在mRNA降解通路中明顯富集。然而相較MCL損傷后相關(guān)環(huán)狀RNA呈下調(diào)趨勢，ACL損傷后差異環(huán)狀RNA則明顯上調(diào)，兩者截然不同的表現(xiàn)可能進(jìn)一步導(dǎo)致了二者自愈能力的差異。

在ce RNA網(wǎng)絡(luò)中，NC_013686.1：35078653|351在ACL損傷后與MCL損傷后的差異ceRNA網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)度均較高，下游靶向EFCC1、PKP4、ARHGAP44、STUM基因，提示可能與免疫細(xì)胞衰老[19]、本體感受神經(jīng)元的機(jī)械傳感密切相關(guān)[20]。在MCL損傷后的差異ceRNA網(wǎng)絡(luò)中STUM為中心靶基因，而NW_003159656.1：66918|127907相關(guān)度最高，可調(diào)節(jié)多個(gè)miRNA，其在ACL損傷后卻無差異，提示可能為ACL與MCL修復(fù)能力差異的原因之一。NC_013686.1：35078653|351與NW_003159656.1：66918|127907可能在ACL與MCL修復(fù)中扮演著重要角色。

本研究也存在著一定的不足，環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫十分龐雜，由于時(shí)間與條件的限制，本研究僅進(jìn)行了初步的理論分析與差異驗(yàn)證，具體環(huán)狀RNA在ACL修復(fù)中的作用以及ACL可能的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制仍待探究。