黃芩苷通過PI3K/Akt/mTOR通路參與子癇前期大鼠免疫狀態(tài)及炎癥反應(yīng)的調(diào)控及機(jī)制

喬 蕾 李 曼 王雪飛 劉 萍

（德州市婦幼保健院，德州 253000）

子癇前期是妊娠性特異性疾病，臨床主要表現(xiàn)是蛋白尿和血壓升高，對(duì)圍產(chǎn)兒和孕產(chǎn)婦的生命安全具有嚴(yán)重的威脅[1，2]。正常的妊娠會(huì)伴有輕度的全身炎癥反應(yīng)，而子癇前期通常伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，且子癇前期孕婦免疫耐受及機(jī)體免疫平衡嚴(yán)重失調(diào)，導(dǎo)致炎癥因子大量產(chǎn)生，加快子癇前期疾病的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程[3-4]。黃芩苷可抑制核因子κB（NF-κB）蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)[5]。磷酸肌醇三激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt/PKB）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是重要的自噬通路，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中具有重要作用，研究顯示PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活可能與 NF-κB 信號(hào)通路的抑制存在直接或間接的關(guān)系[6-7]，推測(cè)黃芩苷有可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。本文探討黃芩苷通過PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)子癇前期大鼠免疫狀態(tài)及炎癥反應(yīng)的調(diào)控及機(jī)制。

1 材料和材料

1.1 動(dòng)物與材料

取SPF級(jí)SD大鼠60只，3~4月齡，雌性36只，體質(zhì)量（180±20）g，雄性24只，體質(zhì)量（280±20）g，動(dòng)物許可證號(hào)（SYXK（京）2019-0054）。黃芩苷注射液（美國(guó) Sigma-Aldrich公司）；L-精氨酸甲酯（南京奧多福生物技術(shù)有限公司）。

1.2 模型的建立、分組與給藥方案

將雌雄大鼠同籠飼養(yǎng)，每天進(jìn)行陰道涂片，當(dāng)涂片上有陰道上皮細(xì)胞和精子時(shí)記為妊娠第1天。將36只雌性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和處理組，每組12只。處理組和模型組大鼠妊娠13~21 d時(shí)給予L-精氨酸甲酯，皮下注射，給藥劑量為100 mg/kg，對(duì)照組大鼠皮下注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥至妊娠21 d；處理組大鼠于妊娠17~21 d 時(shí)給予黃芩苷注射液，腹腔注射，給藥劑量為 100 mg·kg-1·d-1），同時(shí)對(duì)照組和模型組大鼠均給予等量的生理鹽水，3組均持續(xù)給藥至妊娠21 d。

1.3 取大鼠腹主動(dòng)脈血和胎盤

妊娠21 d時(shí)，采用電腦尾袖式血壓計(jì)測(cè)定各組大鼠的血壓，然后麻醉大鼠，取大鼠腹主動(dòng)脈血，離心后取上清液備用；然后取出大鼠完整胎盤，備用。

1.4 測(cè)定血清尿素氮水平

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清中尿素氮（BUN）水平。

1.5 炎癥因子水平的測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法，測(cè)定大鼠血清中胎盤組織中炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，試劑盒購(gòu)于羅氏生物檢測(cè)應(yīng)用公司。

1.6 用BCA法測(cè)定大鼠胎盤組織勻漿中蛋白含量

將大鼠胎盤組織研磨，加蛋白酶抑制劑的裂解液進(jìn)行裂解，于3 500 r/min、4℃離心15 min。取上清液，采用BCA法測(cè)定大鼠胎盤組織勻漿中蛋白含量，采用SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，將目的條帶分離出，胎牛血清封閉2 h，加入相應(yīng)一抗孵育一夜，PBST洗滌3次，加入熒光二抗孵育2 h，PBST洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯影，測(cè)定灰度值變化。然后用相應(yīng)試劑盒測(cè)定勻漿中Akt、mTOR蛋白含量和尿蛋白水平和炎癥介質(zhì)NF-κB和IκB-α蛋白表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參，免疫熒光成像系統(tǒng)顯示灰度值，用Image J圖像軟件計(jì)算灰度值。

1.7 采用RT-qPCR法測(cè)定大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達(dá)水平

將胎盤組織研磨，根據(jù)RNeasy mini試劑盒操作說明提取總RNA，采用分光光度計(jì)法測(cè)定組織中RNA濃度，取部分總RNA，加入RNA模 板，反 轉(zhuǎn) 錄 為cDNA，RT-qPCR實(shí) 驗(yàn) 采用QuantiFast SYBR Green PCR Kit。β-actin為 內(nèi)參，α7nAChR引 物 序 列 （5'-3'）：CTCACAGCAT- GCAATCCAAGTACACTA（F），CAGGACCGAAGGCTAAAAGAGCA（R）；β-actin引 物 序 列 （5'-3'）：CCGGAGCTTCACCAATTGACACA（F），CAGACGCAGGAGCAGTTAATCA（R）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變形10 s，60℃退火/延伸30 s，進(jìn)行40循環(huán)，數(shù)據(jù)分析采用公式2-ΔΔCt計(jì)算α7nAChR RNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定大鼠全血中T淋巴細(xì)胞的比例

大鼠眼眶取血1.5 mL至潤(rùn)有肝素鈉的管中，加入等體積Hanks液稀釋，加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心20 min，將交界處的單個(gè)核細(xì)胞吸取出來(lái)，加入3 mL Hanks液，混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1640培養(yǎng)基重懸，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量調(diào)整細(xì)胞濃度，加入到24孔板中，5×105細(xì)胞/孔，然后加入1640培養(yǎng)基至1 mL，加20 μL FITC標(biāo)記的各因子抗體，避光室溫孵育30 min，加1%BAS-PBS液進(jìn)行洗滌，稀釋至300 μL后移入到試管中，采用BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓、尿蛋白和BUN水平

模型組大鼠舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），處理組舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（表1）。

2.2 各組大鼠炎癥因子水平

模型組大鼠血清中和胎盤中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），處理組IL-6、IL-1β和TNF-α水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（表2）。

2.3 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平

模型組大鼠Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），處理組Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平與模型組相比均顯著升高（P＜0.05）（圖1，表4）。

表1 各組大鼠血壓、BUN和尿蛋白水平（n=12，±s）

表1 各組大鼠血壓、BUN和尿蛋白水平（n=12，±s）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 舒張壓（mmHg） 收縮壓（mmHg） BUN（mmol/L） 尿蛋白（mg/mL）對(duì)照組 71.45±9.53 106.58±11.24 4.21±0.48 3.25±0.39模型組 155.57±12.58* 203.58±12.44* 13.02±0.74* 9.70±1.04*處理組 71.63±12.02# 107.48±11.48# 4.67±0.45# 3.54±0.35#

表2 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 IL-6 IL-1β TNF-α對(duì)照組 43.58±7.44 164.34±23.45 101.29±12.42模型組 99.38±12.59* 275.83±32.00* 198.48±11.55*處理組 59.48±9.56# 189.57±29.57# 135.67±12.52#

表3 各組大鼠胎盤組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

表3 各組大鼠胎盤組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 IL-6 IL-1β TNF-α對(duì)照組 6.03±0.98 21.05±4.25 5.03±0.92模型組 20.19±2.48* 39.55±5.01* 15.34±2.44*處理組 10.48±1.97# 25.49±3.29# 7.35±2.22#

圖 1 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平

表4 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平（n=12，±s）

表4 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平（n=12，±s）

*P＜0.05 vs對(duì)照組比較；#P＜0.05 vs模型組

組別 Akt mTOR對(duì)照組 1.20±0.22 1.12±0.21模型組 0.47±0.08* 0.46±0.09*處理組 0.85±0.09# 0.89±0.10#

2.4 各組大鼠炎性介質(zhì)NF-κB和IκB-α蛋白表達(dá)水平

模型組大鼠NF-κB和IκB-α蛋白表達(dá)水平顯著高于 對(duì)照組（P＜0.05），處理組NF-κB和IκB-α蛋白表達(dá)水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（圖2，表5）。

圖 2 各組大鼠炎性介質(zhì)NF-κB和IκB-α蛋白表達(dá)水平

表5 各組大鼠炎性介質(zhì)NF-κB和IκB-α蛋白表達(dá)水平 （n=12，±s）

表5 各組大鼠炎性介質(zhì)NF-κB和IκB-α蛋白表達(dá)水平 （n=12，±s）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 NF-κB IκB-α對(duì)照組 0.32±0.07 0.28±0.08模型組 1.25±0.21* 0.98±0.12*處理組 0.63±0.11# 0.34±0.07#

2.5 各組大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達(dá)水平

模型組與對(duì)照組胎盤組織中α7nAChR RNA表達(dá)水平相當(dāng)（P＞0.05）；研究組大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達(dá)水平（6.65±0.91）顯著高于模型組（2.02±0.61）和對(duì)照組（1.53±0.67）（P＜0.05）。

2.6 各組大鼠血中免疫功能參數(shù)水平

結(jié)果顯示（表6），模型組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水 平 均 顯 著 高 于 對(duì) 照 組（P＜0.05），CD8+水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；處理組大鼠與模型組相比，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均顯著降低（P＜0.05），CD8+水平顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

子癇前期主要癥狀是水腫、蛋白尿和高血壓[8，9]。黃芩苷屬于天然植物藥，對(duì)子癇前期大鼠胎盤中的滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，且可調(diào)節(jié)X-連鎖凋亡，進(jìn)而對(duì)蛋白的表達(dá)起到抑制作用，并降低caspase-9的表達(dá)，改善線粒體超微結(jié)構(gòu)，達(dá)到治療子癇前期的作用[10]。本研究結(jié)果顯示，子癇前期模型大鼠舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平均明顯高于對(duì)照組，而處理組舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平與模型組相比均顯著降低，提示黃芩苷可以降低子癇前期大鼠舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平。

表6 各組大鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平（n=12，±s）

表6 各組大鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平（n=12，±s）

*P＜0.05，與對(duì)照組比較；#P＜0.05，與模型組比較。

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+對(duì)照組 56.38±2.43 31.19±1.87 22.25±1.74 1.45±0.06模型組 67.03±2.64* 49.33±1.64* 18.45±1.54* 2.65±1.00*處理組 60.44±2.53# 39.42±2.01# 21.38±1.64# 1.87±0.32#

子癇前期大鼠伴有嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)，包括內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的激活，且有大量中性粒細(xì)胞活化，介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)。過度的炎癥反應(yīng)會(huì)損傷胚胎組織滋養(yǎng)細(xì)胞，并降低其浸潤(rùn)能力，進(jìn)而過度凋亡，且會(huì)損傷血管內(nèi)皮，誘導(dǎo)促炎因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附因子等大量分泌，造成嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，使子癇前期大鼠胎盤缺氧缺血造成的損傷進(jìn)一步加重，造成胎盤組織血流灌注嚴(yán)重不足，使細(xì)胞損傷及凋亡加速，導(dǎo)致各臟器血流灌注均降低，加速子癇前期疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，出現(xiàn)蛋白尿、高血壓等 癥 狀[11-12]。IL-6、IL-1β和TNF-α在 子 癇 前 期 的炎癥反應(yīng)中起到重要作用，可用于反映子癇前期嚴(yán)重程度[13-14]。以往研究結(jié)果顯示，子癇前期大鼠給予MgSO4治療可以降低炎癥因子IL-1β和TNF-α水平，給予抗炎細(xì)胞因子IL-10可以改善尿蛋白排泄和血壓，給予免疫抑制劑治療可以減輕炎癥反應(yīng)、改善癥狀。這些研究結(jié)果顯示抑制子癇前期大鼠炎癥反應(yīng)可以有效改善臨床癥狀[15]。NF-κB是細(xì)胞中廣泛存在的一種蛋白因子，其家族中p65亞單位具有重要的促炎作用，可激活多種炎癥因子，IL-1和TNF-α是NF-κB的 靶 基 因 和 激 動(dòng) 劑，NF-κB激 活后會(huì)促進(jìn)IκB-α表達(dá)，IκB-α又會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)[16]。巨噬細(xì)胞上的α7nAChR可與胎盤內(nèi)源性釋放的乙酰膽堿結(jié)合抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生，α7nAChR對(duì)NF-κB途徑具有一定的控制作用[17]。

PI3K是磷脂酰肌醇激酶，同時(shí)具有絲/蘇氨酸激酶和磷脂酰肌醇激酶活性，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。正常條件下，PI3K在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較少，而當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素等細(xì)胞外信號(hào)分子被激活，促使PI3K表達(dá)上調(diào)。Akt是PI3K下游信號(hào)分子，在PI3K/Akt/mTOR通路中處于核心地位，PI3K激活后會(huì)產(chǎn)生第二信使PIP3，進(jìn)而使Akt完全活化，活化后的Akt會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，對(duì)其下游靶分子進(jìn)行調(diào)控。mTOR屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)的激酶家族，多條信號(hào)通路匯聚于此，激活后的Akt進(jìn)一步激活mTOR，然后繼續(xù)調(diào)控其下游靶蛋白，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。PI3K/Akt/mTOR通路在細(xì)胞凋亡、增殖及血管生成等過程具有重要的作用，有研究顯示通過降低Akt水平和mTOR水平即抑制PI3K/Akt/mTOR通路可以抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，降低血管生成能力[18]。而黃芩苷對(duì)該信號(hào)通路具有促進(jìn)作用，進(jìn)而改善胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力和血管生成能力[19-20]。本研究結(jié)果顯示，處理組IL-6、IL-1β、TNF-α水 平 和NF-κB、IκB-α蛋 白 表 達(dá) 水平與模型組相比均顯著降低，處理組大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達(dá)水平顯著高于模型組和對(duì)照組，處理組Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平與模型組相比均顯著升高。另有研究顯示，PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活可能與 NF-κB 信號(hào)通路的抑制存在直接或間接的關(guān)系[7]，提示黃芩苷可以上調(diào)Akt和mTOR表達(dá)水平，促進(jìn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，降低血管內(nèi)皮損傷，改善血管內(nèi)皮功能，從而降低炎性反應(yīng)。

子癇前期大鼠伴有免疫功能失調(diào)，機(jī)體正常條件下CD4+/CD8+處于穩(wěn)態(tài)平衡，免疫失調(diào)時(shí)，該平衡會(huì)被打破[21]。NF-κB的活化與機(jī)體免疫有密切關(guān)系，其在T細(xì)胞的活化和樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞方面具有重要的參與作用。樹突狀細(xì)胞大量表達(dá)IκB-α后會(huì)對(duì)NF-κB的活性起到抑制作用，引發(fā)免疫耐受[22-23]。mTOR信號(hào)途徑在維持T細(xì)胞的生長(zhǎng)及其活化、分化及代謝等生理過程發(fā)揮作用，活化的T細(xì)胞可刺激信號(hào)CD28，進(jìn)而活化PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，而黃芩苷可促進(jìn)該信號(hào)通路，進(jìn)而提高機(jī)體免疫功能[24，25]。本研究結(jié)果顯示，處理組大鼠與模型組相比，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均顯著降低，CD8+水平顯著升高，提示黃芩苷可通過促進(jìn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路提高子癇前期大鼠機(jī)體免疫功能。

綜上，黃芩苷可以通過促進(jìn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善機(jī)體免疫功能。