細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1在甲狀腺素誘導(dǎo)的母源性甲狀腺功能亢進(jìn) 仔鼠心肌中的差異表達(dá)*

李 斌 陳 晶△ 張 聿 楊 靜 姜雅潔 楊浩天 奇佳欣 劉玥欣 馬添穎 趙孟乙 高 灝

（包頭醫(yī)學(xué)院，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，2 2019級臨床本科，3 2018級臨床本科，包頭 014040）

近年來，甲狀腺疾病發(fā)病率逐年增高，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球甲狀腺疾病人群發(fā)病率約5%~8%[1]，我國甲狀腺疾病患病率也呈逐年攀升態(tài)勢[2-4]，尤其在青壯年人群和育齡期婦女中甲狀腺疾病的發(fā)病率尤為明顯增高[5]，對來自中國31個省區(qū)的78 470名年齡在18歲或以上的調(diào)查研究顯示，顯性甲狀腺功能亢進(jìn)（甲亢）發(fā)病率0.78%，亞臨床甲亢0.44%，格雷夫斯病0.53%，顯性甲減1.02%[6-7]。甲狀腺疾病中甲亢的發(fā)病率也呈逐年增加，在歐洲甲亢的患病率為0.8%，在美國為1.3%[8]，到2014年我國甲亢患者超過1000萬，甲亢的患病率近2%[8-9]。甲亢男女發(fā)病比例為1∶6，其中80%患者為中青年女性，而甲狀腺疾病知曉率、治療率卻比較低[10]，如甲亢未得到控制時妊娠，可能引起新生兒低體質(zhì)量、生長發(fā)育受限、早產(chǎn)率增高等癥狀[11]。Matsumoto等[12]報(bào)道1例重度的母源性甲亢導(dǎo)致胎兒甲亢并出現(xiàn)心力衰竭。本課題組前期研究結(jié)果也表明，母源性甲亢會對仔鼠心造成一定的影響[13-14]。過量的甲狀腺激素通過何種信號通路途徑影響仔鼠心，相關(guān)研究較少。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及造模

成年Wistar雌性大鼠30只（購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心（SCXK 2002-0004），體質(zhì)量180~210 g；成年雄鼠6只（購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心（SCXK 2002-0004），280~320 g。室溫18~25℃，相對濕度50%~70%，動物室保持清潔通風(fēng)。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，雌性大鼠隨機(jī)分為甲亢組和對照組，甲亢組20只，對照組10只，連續(xù)經(jīng)口灌胃給藥，1次/天。模型組按100 mg·kg-1·d-1灌胃甲狀腺素片（山東中泰藥業(yè)股份有限公司），對照組灌服生理鹽水 10 mL·kg-1·d-1。每天記錄飲食、飲水量，行為指征；每隔3天稱量體質(zhì)量，調(diào)整給藥量。發(fā)現(xiàn)行為指征出現(xiàn)甲亢癥狀，眶靜脈采血2~3 mL，采用競爭性放射免疫分析方法檢測游離三碘甲腺原氨酸（FT3）、游離四碘甲腺原氨酸（FT4）（山東濰坊市三維診斷技術(shù)有限公司，20100105B）。檢測確定甲亢后，挑選發(fā)情期雌鼠與雄鼠2∶1合籠，次日晨行陰道涂片檢查，鏡下發(fā)現(xiàn)有精子視為交配，并記為孕0天，受孕期間繼續(xù)灌胃。

1.2 取材、解剖檢查及形態(tài)學(xué)檢查

分別取出生10 d仔鼠心臟。肉眼觀察有無外觀畸形及內(nèi)部分隔畸形。取左心室心肌組織分別浸入Bouin氏固定液和10%中性甲醛溶液中，常規(guī)脫水、包埋，石蠟切片，分別行Masson染色和H-E染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。取1 mm3的組織塊浸入2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄切片，再用檸檬酸鉛、醋酸鈾雙重染色后，透射電子顯微鏡下觀察。

1.3 實(shí)時定量PCR檢測

1.3.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 取心臟組織，液氮速凍后，提取總RNA（TaKaRa RNAiso Plus），對其進(jìn)行完整性檢測和濃度測定，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa PrimeScript?RT Reagent Kit）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存。

1.3.2 合成引物和內(nèi)參 引物和內(nèi)參由上海生工合成，序列如表1所示。

表1 實(shí)時定量PCR引物序列

1.3.3 實(shí)時定量PCR 使用TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ RT-PCR kit，使用ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System。反應(yīng)體系為SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，Primer各0.4 μL（20 μmol/L），ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模板1 μL，dH2O 7.8 μL，共20 μL。將cDNA樣 品模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，尋找最佳PCR擴(kuò)增循環(huán)條件，每個樣品重復(fù)3次。最終循環(huán)條件為：①預(yù)變性：95℃ 30 s；②PCR反應(yīng)：40個循環(huán)，95℃ 5 s，60℃ 30 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) 實(shí)時定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，確認(rèn)產(chǎn)物特異性。

1.4 免疫印跡檢測ERK的表達(dá)

使用RIPA裂解液（北京碧云天）提取心肌組織的總蛋白質(zhì)，使用BCA試劑盒（北京碧云天）進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）后轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜。以稀釋后的單克隆一抗（1∶500，Santa Cruz）4℃孵育過夜，再與二抗（1∶2000，Santa Cruz）反應(yīng)1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京碧云天）顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 11.5分析，進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，采用±s表示。計(jì)算基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法，即由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。

2 結(jié)果

2.1 造模

甲亢組大鼠出現(xiàn)易怒好斗、飲食飲水量多，部分大鼠毛色枯槁，對照組未見異常。在造模之前和之后稱重大鼠的體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)后對照組大鼠體重自然增長，平均增長約（36.60±3.76）g；甲亢組增長緩慢，平均增長約（23.50±8.75）g，差異極顯著（P=0.01）。甲功檢測結(jié)果顯示甲亢組FT3為（6.72±1.68）pmol/L，對照組為（4.05±0.58）pmol/L，差異極顯著（P=0.000）；甲亢組FT4為（18.59±5.27）pmol/L，對照組為（10.23±1.81）pmol/L（P=0.000），差異極顯著。

2.2 形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果

所有仔鼠中肉眼下未檢出明顯心臟外觀畸形，心臟分隔也未見明顯異常。經(jīng)Masson染色，膠原纖維被染為藍(lán)色。從圖中可見，甲亢組仔鼠心肌細(xì)胞排列不整齊，心肌間膠原纖維等結(jié)締組織增多（圖1-B1、B2）。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)母源性甲亢仔鼠心肌細(xì)胞體積增大，線粒體大小不均、形態(tài)不規(guī)則（圖1B3）；對照組心肌細(xì)胞排列整齊，線粒體呈橢圓形、大小均勻、排列整齊（圖1A3）。

圖1 仔鼠心肌組織光鏡、電鏡圖

2.3 實(shí)時定量PCR結(jié)果

實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，母源性甲亢仔鼠心肌中ANP、BNP、β-MHC在mRNA水平的表達(dá)量均有顯著上調(diào)，其中ANP的表達(dá)量比正常仔鼠上調(diào)了約50%，BNP mRNA的表達(dá)量比正常仔鼠上調(diào)了約80%，β-MHC mRNA的表達(dá)量比正常仔鼠上調(diào)了約58%（圖2）。母源性甲亢仔鼠心肌ERK1 mRNA的表達(dá)量比正常仔鼠上調(diào)了約30%（圖2D）；CaMK-Ⅱ、PI3K、STAT-3在各組仔鼠心肌中的表達(dá)量無顯著性差異（圖2E、2F、2G）。

2.4 ERK1、CaMK-Ⅱ、PI3K、STAT-3表達(dá)

免疫印跡檢測結(jié)果顯示母源性甲亢仔鼠心肌組織中ERK1的表達(dá)量高于對照組，CaMK-Ⅱ、STAT-3、PI3K的表達(dá)無顯著性差異。

3 討論

大量研究表明在結(jié)扎腹主動脈建立的小鼠心肌肥厚模型中，心肌組織中的ANP、BNP、β-MHC mRNA水平表達(dá)升高[15-18]。本研究在Wistar雌性大鼠持續(xù)灌胃甲狀腺素后受孕分娩的仔鼠中也發(fā)現(xiàn)心肌組織中存在ANP、BNP、β-MHC mRNA水平的高表達(dá)；電鏡超微結(jié)構(gòu)結(jié)果也顯示母源性甲亢仔鼠心肌細(xì)胞體積增大，線粒體大小不均、形態(tài)不規(guī)則。結(jié)果提示母體過量的甲狀腺素可以對仔鼠心肌組織產(chǎn)生影響。

產(chǎn)婦甲亢時，胎兒組織暴露于過量的甲狀腺激素，這可能會破壞胎兒和新生兒調(diào)節(jié)促甲狀腺激素（TSH）和T4水平的能力[19]。Ribeiro等[20]認(rèn)為母體通過胎盤和乳汁轉(zhuǎn)移多余的母體甲狀腺素可能導(dǎo)致新生兒甲亢，胎兒下丘腦-垂體-甲狀腺系統(tǒng)暴露于高濃度的母體甲狀腺素，甚至在胎兒沒有甲亢的情況下，可能會損害胎兒的生理成熟。過量的甲狀腺素又是如何影響新生兒心臟的呢？相關(guān)報(bào)道較少。甲狀腺素除了可以通過與位于靶基因啟動子上的保守甲狀腺素反應(yīng)元件相關(guān)的核甲狀腺激素受體結(jié)合而發(fā)揮作用，還可能通過“非基因組作用”對細(xì)胞內(nèi)信號通路具有新的作用[15，21]。有研究認(rèn)為T4可以結(jié)合到未能識別的膜受體，在10~30 min內(nèi)，激活Ras、Raf1、MEK和PKC導(dǎo)致酪氨酸磷酸化，激活MAPKs核轉(zhuǎn)錄[22]。母源性甲亢是否會通過某種細(xì)胞內(nèi)信號通路發(fā)揮作用呢？

圖2 各相關(guān)基因在仔鼠心肌組織中mRNA水平的相對表達(dá)量

圖3 ERK1在仔鼠心肌組織中的表達(dá)

本研究中發(fā)現(xiàn)母源性甲亢仔鼠心肌組織中ERK1表達(dá)上調(diào)。在哺乳類動物細(xì)胞中，與ERK相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是經(jīng)典MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，ERK即細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，主要包括ERK1和ERK2。在ERKs的傳遞途徑中Ras作為上游激活蛋白，Raf作為MAPKKK，MAPK/ERK激酶（MEK）作為MAPKK，ERK即MAPK，即Ras-Raf-MEK-ERK途徑。研究表明，異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌組織 p-Raf與p-ERK1/2表達(dá)明顯增多，認(rèn)為p-Raf與p-ERK1/2是心肌肥厚的正性調(diào)節(jié)因子[23]。本研究結(jié)果也表明母源性甲亢會引起心肌肥厚相關(guān)基因ANP、BNP、β-MHC的高表達(dá)。然而過量的甲狀腺激素又是如何引起ERK的差異表達(dá)的，ERK又將如何影響其下游轉(zhuǎn)錄因子，還有待下一步深入研究。