不同濃度七氟醚對大鼠海馬去甲腎上腺素、5-羥色胺水平 及P2X3表達(dá)的影響

陳 勇 龐紅利 宋俊杰 張 晗 毛珊珊 彭 莉 王 瑩

（河南大學(xué)，1 第一附屬醫(yī)院，開封 475001；2 醫(yī)學(xué)院，開封 475004）

七氟醚是臨床廣泛應(yīng)用的無色透明吸入麻醉藥劑。吸入七氟醚，患者在120 s左右意識模糊[1]，即可進(jìn)行手術(shù)，臨床上廣泛應(yīng)用于兒童，使用較為廣泛[2]，但隨著在使用過程中及對術(shù)后患者癥狀深入研究顯示，七氟醚會降低患者體內(nèi)去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平及對嘌呤能受體（purinergic receptor）P2X3表達(dá)產(chǎn)生抑制作用[3-4]。七氟醚可抑制NE再提取，5-HT可能作為吸入式麻醉藥物影響認(rèn)知功能的靶點(diǎn)，被證實(shí)吸入式麻醉藥物會消耗5-HT，降低大鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)能力[5]。 P2X3為痛覺的相關(guān)受體，已有研究表明，外周P2X3受體在初級感覺神經(jīng)元介導(dǎo)的痛覺中發(fā)揮重要作用，能夠參與不同類型病理性疼痛的發(fā)生和維持，通過吸入式麻藥進(jìn)行麻醉，在手術(shù)中使痛覺受體P2X3的表達(dá)明顯降低，從而減輕患者因手術(shù)等造成的痛感[6-7]。但七氟醚作為一種吸入式麻醉藥劑，對P2X3受體的影響機(jī)制尚不明確，因此，本研究通過大鼠實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度的七氟醚對大鼠NE、5-HT水平及P2X3表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

120只健康雄性大鼠購自河南省動物實(shí)驗(yàn)中心，鼠齡8周左右，體質(zhì)量290~300 g，室溫為24℃左右，自由采食和攝水，在無壓環(huán)境下讓大鼠適應(yīng)1周新環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動物編號：SYXK（滬）2017-0015。

1.2 試劑與儀器

本次實(shí)驗(yàn)所用到的試劑和儀器分別是：七氟醚（孟成科技有限公司）、P2X3一抗、羊抗兔二抗和Cy3熒光二抗（均購自北京方程嘉鴻科技）；Datex-Ohmeda監(jiān)護(hù)儀。

1.3 動物分組與模型建立

揮發(fā)罐內(nèi)加入七氟醚，連接好小動物麻醉機(jī)管路和Datex-Ohmeda監(jiān)護(hù)儀及麻醉氣體檢測套件，將麻醉誘導(dǎo)箱關(guān)閉后預(yù)充入七氟醚和氧氣，放入大鼠。對照組吸入1∶1氧氣與空氣的混合氣體2 h，七氟醚低、中及高劑量組分別吸入1%、2%及3%的七氟烷與氧氣混合氣體2 h[8]。待麻醉完成后關(guān)閉麻醉罐連接七氟醚氣體吸附器，待大鼠自然蘇醒，活動自如后回籠。

1.4 大鼠麻醉后行為測定

逃逸平臺隨機(jī)放置任意象限（3象限除外），放入水中的大鼠若60 s內(nèi)爬上平臺，停留20 s，若找不到，則引導(dǎo)其至平臺，停留20 s，形成即時(shí)空間記憶。間隔30 s后重復(fù)上述操作，記錄潛伏期。麻醉前一天撤去平臺，將大鼠沿槽壁放入水中，記錄120 s內(nèi)目標(biāo)象限持續(xù)時(shí)間、目標(biāo)象限路程、穿越平臺次數(shù)，計(jì)算原平臺所在象限時(shí)間占總時(shí)間比、原平臺所在象限路程占總路程比。

1.5 高效液相檢測NE、5-HT含量

大鼠斷頭處死，在冰上迅速剝離出右側(cè)海馬，稱重，加入0.4 mL預(yù)冷的工作內(nèi)標(biāo)液，快速勻漿，靜置10 min，4℃條件下10 000 r/min離心15 min，取上清液，過濾，-80℃保存，檢測NE、5-HT的含量。

1.6 免疫熒光組織化學(xué)檢測P2X3

4組大鼠麻醉，取鼠腦海馬CA1區(qū)組織，4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋切片，片厚約10 μm。脫蠟、水化、熱抗原修復(fù)和滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，BSA封閉后加入P2X3一抗（1∶500），4℃過夜，滴加Cy3熒光二抗（1∶500），避光孵育1 h，顯微鏡下觀察結(jié)果，顯現(xiàn)紅色熒光為P2X3受體陽性。

1.7 免疫印跡檢測

4組大鼠麻醉，取腦海馬組織，裂解組織，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，TBST沖洗，加入P2X3單克隆抗體（1∶ 1 000），4℃孵育過夜，羊抗兔二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，采用ECL曝光拍照，軟件分析條帶灰度值，每組重復(fù)檢測3次。

1.8 海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)觀察

麻醉結(jié)束后12 h，取出腦組織，于冰上迅速分離一側(cè)大腦海馬，液氮速凍后-80℃保存，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，沿視交叉后4 mm行連續(xù)冠狀切片，切片行H-E染色后觀察海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量。

1.9 TUNEL檢測海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

將厚度為2 μm的海馬組織石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)PBS清洗，2%H2O2室溫孵育10 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，15 μg/mL蛋白酶K消化15 min，37℃，PBS沖洗，浸入37℃ TUNEL 混合液1 h（200 μL中含1 μL TDT 20 μ/mL和l μL FITC-dUTP混合液），PBS沖洗，0.05%H2O2顯色 5 min，并采用流水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精染 1 min，水洗后鹽酸乙醇分化30 s，水洗藍(lán)化以常規(guī)樹脂封片，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞呈棕黃色，每張切片在200倍鏡下隨機(jī)選擇10個視野進(jìn)行觀察。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件分析，計(jì)量資料用±s表示，4組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻醉后大鼠行為變化

對照組大鼠在蘇醒1 d逃避潛伏期（46.23± 5.31）s明顯低于中、低七氟醚組（P＜0.05），并且隨著七氟醚濃度的升高，蘇醒后2~5 d逃避潛伏期逐漸增長（P＜0.05），中、低七氟醚組隨著蘇醒時(shí)間的增長逃避期下降，高七氟醚組在蘇醒后1~2 d逃避潛伏期時(shí)間相似，均在第3天出現(xiàn)下降，且各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期明顯長于中、低七氟醚組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠麻醉后逃避潛伏期的變化（±s，s）

表1 各組大鼠麻醉后逃避潛伏期的變化（±s，s）

*P＜0.05 vs對照組；#P＜0.05 vs低七氟醚組；△P＜0.05 vs中七氟醚組

組別 蘇醒后1 d 蘇醒后2 d 蘇醒后3 d 蘇醒后4 d 蘇醒后5 d對照組 46.23±5.31 25.23±2.67 16.41±3.61 9.82±1.12 6.22±0.78低七氟醚組 48.71±5.34 30.23±1.44* 20.42±3.14* 15.55±2.91* 11.78±1.67*中七氟醚組 51.78±6.43* 35.61±3.24*# 25.43±2.28*# 19.67±2.15*# 14.45±1.78*#高七氟醚組 53.56±6.21* 50.41±5.86*#△ 45.45±5.01*#△ 42.24±4.72*# 39.34±4.21*#

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對照組相比，低、中、高七氟醚組麻醉后1 d穿越原平臺次數(shù)、總路程差距較?。≒＞0.05），7 d穿越原平臺次數(shù)、總路程、目標(biāo)象限路程差距較?。≒＞0.05），低、中、高七氟醚組各時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)象限持續(xù)時(shí)間縮短，原平臺所在象限時(shí)間占總時(shí)間比、原平臺所在象限路程占總路程比下降（P＜0.05），高七氟醚組麻醉后1 d目標(biāo)象限路程縮短（P＜0.05）。與低七氟醚組相比，中七氟醚組的各指標(biāo)均無差異（P＞0.05）。與低、中七氟醚組相比，高七氟醚組麻醉后1 d目標(biāo)象限持續(xù)時(shí)間縮短，原平臺所在象限時(shí)間占總時(shí)間比、原平臺所在象限路程占總路程比下降（P＜0.05）（表2）。

表2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比（±s）

表2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比（±s）

*P＜0.05 vs對照組；#P＜0.05 vs低七氟醚組；△P＜0.05 vs中七氟醚組

組別 蘇醒后時(shí)間目標(biāo)象限持續(xù)時(shí)間（s）目標(biāo)象限路程（cm） 總路程（cm） 穿越平臺次數(shù)（次）原平臺所在象限時(shí)間占總時(shí)間比原平臺所在象限路程占總路程比對照組 1 d 35.22±6.31 410.14±45.63 1526.33±125.44 2.45±0.36 0.29±0.06 0.29±0.06*7 d 36.13±6.14 442.26±62.31 1564.21±178.62 3.22±0.74 0.31±0.06 0.31±0.06*低七氟醚組 1 d 27.62±3.11* 361.42±33.41 1633.42±147.26 2.61±0.32 0.24±0.03* 0.24±0.03*7 d 26.35±4.12 358.25±31.62 1699.24±152.33 1.33±0.24 0.23±0.05* 0.23±0.05*中七氟醚組 1 d 27.54±3.05* 352.64±30.11 1602.14±152.34 1.12±0.13 0.24±0.02* 0.24±0.02*7 d 27.67±4.22* 336.14±35.27 1592.37±149.26 1.34±0.24 0.24±0.07* 0.24±0.07*高七氟醚組 1 d 20.42±2.13*# 282.31±26.37* 1781.33±182.46 2.24±0.31 0.17±0.03*#△ 0.17±0.03*#△7 d 27.82±3.11* 385.47±40.12 1822.33±192.36 2.84±0.29 0.23±0.04* 0.23±0.04*

2.3 海馬NE、5-HT含量變化

與對照組大鼠海馬NE、5-HT水平比較，吸入七氟醚3組NE水平及5-HT水平明顯降低（P＜0.05），且隨著七氟醚濃度升高，NE、5-HT水平也逐漸降低；高七氟醚劑量組大鼠NE水平及5-HT水平明顯低于中、低七氟醚組（P＜0.05） （表3）。

2.4 免疫熒光組織化學(xué)檢測海馬P2X3表達(dá)變化

各組大鼠腦海馬組織內(nèi)神經(jīng)元均有P2X3蛋白陽性表達(dá)，且表達(dá)程度不相同，其陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞膜處有高表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá)，主要位于中、小神經(jīng)元。對照組因未進(jìn)行麻醉處理，陽性表達(dá)最高，低七氟醚組有較高表達(dá)，隨著七氟醚濃度的升高，P2X3陽性表達(dá)逐漸降低（圖1，見封二）。

圖1 各組大鼠腦組織內(nèi)P2X3表達(dá)，×200。 A：對照組；B：低七氟醚組；C：中七氟醚組；D：高七氟醚組。A1～D1：DAPI染色；A2～D2：FITC染色；A3～D3：合并.圖3 各組大鼠神經(jīng)元形態(tài)，H-E染色，×200。 A：對照組；B：低七氟醚組；C：中七氟醚組；D：高七氟醚組.圖4 各組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較，TUNEL染色，×200。 A：對照組；B：低七氟醚組；C：中七氟醚組；D：高七氟醚組.

表3 各組大鼠海馬區(qū)NE、5-HT含量（±s，ng/g）

表3 各組大鼠海馬區(qū)NE、5-HT含量（±s，ng/g）

*P＜0.05 vs對照組；#P＜0.05 vs低七氟醚組；△P＜0.05 vs中七氟醚組

組別 NE 5-HT對照組 351.09±32.79 403.59±32.01低七氟醚組 328.34±30.69* 346.45±30.91*中七氟醚組 300.01±27.96*# 308.21±31.63*#高七氟醚組 281.63±25.98*#△ 283.04±28.34*#△

2.5 免疫印跡檢測海馬P2X3表達(dá)變化

P2X3/β-actin比值各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對照組P2X3蛋白表達(dá)（0.90±0.04）顯著高于七氟醚高、中、低組（P＜0.05），與低七氟醚組P2X3蛋白表達(dá)（0.80±0.05）比較，中七氟醚組（0.61±0.06）及高七氟醚組（0.39±0.01）P2X3蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠P2X3蛋白表達(dá)

2.6 海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)觀察

H-E染色切片觀察海馬區(qū)錐體神經(jīng)元，對照組和七氟醚低劑量組細(xì)胞較為完整、呈現(xiàn)有序致密，神經(jīng)細(xì)胞大小較均勻。七氟醚中、高劑量組海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞核固縮顯著，但七氟醚高劑量組更顯著（圖3，見封二）。

2.7 海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

結(jié)果顯示，對照組、七氟醚低、中、高組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率分別為12.55%±1.69%，18.42%±2.21%，24.10%±2.66%，36.22%± 3.62%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組相比，七氟醚低、中、高組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4，見封二）。

3 討論

七氟醚是現(xiàn)階段比較常用的吸入式麻醉藥，具有誘導(dǎo)速度快、藥效學(xué)和藥代動力學(xué)特性優(yōu)越、對患者呼吸道安全不會引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病、吸入七氟醚的患者蘇醒較迅速和醫(yī)生能夠較好控制患者麻醉的深淺等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，較廣泛應(yīng)用于臨床麻醉，尤其在兒童手術(shù)中，七氟醚占麻醉藥劑的主導(dǎo)地位，成為臨床上較為常用的一種吸入式麻醉藥。但隨著廣泛使用及術(shù)后患者不良反應(yīng)及癥狀的深入研究，顯示七氟醚麻醉后一般會產(chǎn)生短暫的認(rèn)知障礙，以70歲以上的老年手術(shù)人群為主[11-12]，部分患者認(rèn)知障礙持續(xù)時(shí)間較長，且不可逆。相關(guān)研究表明七氟醚對記憶的形成和誘導(dǎo)神經(jīng)退行性變化產(chǎn)生一定的影響。近年來研究顯示七氟醚麻醉術(shù)后的不良影響表現(xiàn)[13]，影響神經(jīng)及其遞質(zhì)傳遞，如NE、5-HT等，抑制時(shí)效增長。一定濃度的七氟醚導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況明顯，且七氟醚的濃度越高，凋亡情況越明顯，可改變β淀粉樣蛋白表達(dá)[14]，介導(dǎo)七氟醚對細(xì)胞的毒性作用。Tau蛋白過度磷酸化與記憶損害有關(guān)，是誘導(dǎo)阿爾茨海默癥發(fā)病的主要原因之一，表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。七氟醚麻醉可產(chǎn)生短暫可逆的Tau蛋白磷酸化，重復(fù)持續(xù)的麻醉可使Tau磷酸化更持久，也可導(dǎo)致血清白介素6、腫瘤壞死因子α濃度增加。神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)通路是近年研究的熱點(diǎn)[15]，不同濃度七氟醚對大鼠NE、5-HT水平及P2X3通路的影響是本研究主要內(nèi)容。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行信息傳遞產(chǎn)生交流的主要物質(zhì)，并且能夠調(diào)節(jié)哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)，使其產(chǎn)生興奮或抑制[16]。NE、5-HT均屬于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。腦內(nèi)NE主要與體表溫度、人體的運(yùn)動功能表達(dá)、痛覺表達(dá)和激素水平調(diào)節(jié)有關(guān)。5-HT作為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，具有一定傳遞信息的作用，在大腦皮質(zhì)及神經(jīng)突觸內(nèi)含量很高[17]，對信息傳遞過程起抑制作用，并通過分布在各處的5-HT受體起作用，對生理活動具有一定的調(diào)節(jié)作用，如認(rèn)知、情感等。有研究表明，5-HT含量受七氟醚毒性影響較大，七氟醚能夠消耗5-HT，減少海馬組織NE[18]。本研究結(jié)果表明，NE與5-HT水平隨著七氟醚的濃度的增加而降低。在尹彩星等[19]、 尹楠等[20]運(yùn)用不同濃度的七氟醚進(jìn)行研究顯示，5-HT、NE水平隨著七氟醚濃度的增加而降低，影響大鼠的認(rèn)知功能。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，且本研究水迷宮實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明七氟醚影響大鼠的認(rèn)知及行為能力。

P2X3受體屬于嘌呤能受體，包括腺苷作用的P1受體和P2受體，介導(dǎo)痛覺過敏的形成；根據(jù)受體在藥理學(xué)及其生物化學(xué)方面的主要表現(xiàn)，將P2受體分為兩大類：P2X受體和P2Y受體，目前已經(jīng)成為治療疼痛的主要突破口。P2X3主要分布于一些中、小神經(jīng)元，直徑較大的神經(jīng)元上分布較少。P2X3在大鼠腦部也同樣存在。在背根神經(jīng)節(jié)中，P2X3分布于小假單極神經(jīng)元，用于疼痛信息的傳遞[21]。敲除P2X3受體基因的大鼠，顯示該大鼠對疼痛的閾值顯著下降，證實(shí)與該受體缺陷有關(guān)，表明P2X3在傷害性信息傳遞產(chǎn)生中起著一定作用。因此大鼠在通過七氟醚麻醉后痛覺降低，P2X3表達(dá)也隨之降低[22]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著七氟醚濃度的增加，P2X3水平逐漸降低。王玉潔等[23]運(yùn)用舒芬太尼對神經(jīng)病理性疼痛大鼠進(jìn)行研究顯示，舒芬太尼可降低P2X3水平，減少大鼠神經(jīng)性病理疼痛。在邢娟等[24]對偏頭痛大鼠進(jìn)行研究表明，5-HT與P2X3表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，因此本研究認(rèn)為七氟醚可能會通過降低5-HT水平，進(jìn)而降低P2X3表達(dá)，促使大鼠認(rèn)知及行為能力降低，且本研究H-E染色結(jié)果也證實(shí)七氟醚損傷了海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元，海馬區(qū)作為存儲記憶及維持大腦正常功能的區(qū)域，其受到損傷后會進(jìn)一步抑制大鼠學(xué)習(xí)能力。

本研究存在一定不足之處，除了對NE、5-HT以及P2X3受體進(jìn)行檢測外，未對其他遞質(zhì)或受體進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)中缺乏較長時(shí)間觀察組，故對麻醉后出現(xiàn)的認(rèn)知障礙是否可逆存疑，今后應(yīng)增加研究樣本量，充實(shí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為相關(guān)研究提供依據(jù)。

綜上所述，七氟醚作為一種吸入式麻醉藥劑，隨著其濃度的增加，會降低NE、5-HT水平及抑制P2X3表達(dá)，降低大鼠記憶能力。