熊果酸對大鼠海綿體神經(jīng)損傷性勃起功能障礙的治療作用與機制探討

陳云臣 劉洋 楊勇 孫東翀

陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)是指在性刺激情況下成年男性的陰莖難以正?；蚓S持勃起,且無法完成滿意的性交,病程＞6 個月［1］。原發(fā)性神經(jīng)元組織損傷之后,一系列的代謝失調(diào),包括缺血、興奮性毒素、鈣和線粒體失調(diào),最終導致炎癥介導的繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。海綿體神經(jīng)損傷后內(nèi)皮細胞和海綿體平滑肌發(fā)生凋亡,一氧化氮合酶陽性神經(jīng)細胞受到損傷,纖維增生性細胞因子上調(diào),進而出現(xiàn)海綿體平滑肌纖維化［2］。由于對陰莖海綿體神經(jīng)的損傷,根治性前列腺切除術(shù)(radical prostatectomy,RP)術(shù)后導致的ED 發(fā)生率較高［3］,雖然探索中各種治療方法較多,但目前療效明確的方法并不多。熊果酸(ursolic acid,UA)是一種具有多種藥用特性的中藥提取物,在植物界分布較廣泛,如山楂、梔子、山茱萸,車前等中藥中。研究發(fā)現(xiàn),熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗糖尿病、抗?jié)?、降低血?以及明顯的抗氧化功能等多種生物學效應［4,5］。熊果酸在腦、脊髓損傷及神經(jīng)退化性疾病的治療方面有神經(jīng)保護作用［6］,提示其有可能對RP 術(shù)后因海綿體神經(jīng)損傷導致的ED 發(fā)揮潛在的治療作用。因此,本研究以神經(jīng)損傷性ED 大鼠為研究對象,制備陰莖海綿體神經(jīng)損傷模型,觀察熊果酸對大鼠勃起功能恢復的影響,初步探討其相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 18 只購于北京科宇有限公司［許可證號：SCXK(京)2018-0010］健康無病原體 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,8 周齡,體重250～300 g。所有大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后,隨機分為假手術(shù)對照組、模型對照組(雙側(cè)海綿體神經(jīng)損傷)和治療組(雙側(cè)海綿體神經(jīng)損傷+熊果酸治療),每組6 只。

1.2 方法

1.2.1 主要實驗器材及試劑 熊果酸(上海愛必信生物科技有限公司)；MP150 多導電生理儀(美國Biopac公司)；穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(北京六一儀器廠)；Centrifuge 5417R 低溫離心機(美國Eppendorf 公司)；顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械廠)；α-SMA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和N-NOS 兔多克隆抗體(美國Abcam 公司)。全部實驗操作均在解放軍總醫(yī)院動物實驗室開展,參照解放軍總醫(yī)院動物使用指南執(zhí)行。

1.2.2 神經(jīng)損傷模型建立 參照王飛翔等［7］提供的方法建立大鼠神經(jīng)性ED 模型。所有SD 大鼠使用3%戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg 腹腔注射進行麻醉。在下腹部行正中切口,前列腺背外側(cè)找到兩側(cè)盆神經(jīng)節(jié),距盆神經(jīng)節(jié)發(fā)出3～5 mm 處用小彎血管鉗分別鉗夾雙測海綿體神經(jīng),血管鉗扣合至最后一個咬齒,鉗夾海綿體神經(jīng)各2 min。

1.2.3 治療方法 熊果酸溶于1% 二甲基亞砜(DMSO)-磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中,治療組大鼠給予熊果酸50 mg/kg 灌胃,1 次/d；假手術(shù)對照組和模型對照組則給予同樣體積的1% DMSO 在PBS 中作為載體對照,1 次/d。上述治療自海綿體神經(jīng)損傷模型建立后第1 天開始,持續(xù)4 周。

1.2.4 大鼠陰莖海綿體壓力測定及頸動脈測壓 實驗開始4 周后,三組大鼠使用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg進行腹腔注射麻醉。打開大鼠腹腔,找到盆神經(jīng)節(jié)和海綿體神經(jīng),放置刺激電極,測定海綿體內(nèi)壓(intracavernous pressure,ICP),刺激持續(xù)時間設置為60 s,設置參數(shù)：電流強度為1.5 mA、刺激頻率為20 Hz。游離穿刺頸總動脈,測定平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)。通過比較ICPmax/MAP 評估陰莖勃起功能。測壓結(jié)束后深度麻醉處死SD 大鼠,留取陰莖組織,供后續(xù)研究使用。

1.2.5 Masson's 三色染色 應用4%多聚甲醛固定陰莖組織,石蠟包埋并制備4 μm 厚度切片。進行脫蠟、水化后遵照Masson's 試劑盒進行染色。在光鏡下觀察陰莖海綿體,膠原組織被染為綠色,平滑肌組織被染為紅色。使用Image-Pro plus 軟件對海綿體平滑肌/膠原比例進行分析。

1.2.6 免疫組織化學染色 海綿體測壓后深度麻醉處死大鼠,取陰莖中段組織,多聚甲醛固定陰莖組織,石蠟包埋,制備4 μm 厚度切片；進行脫蠟、水化；抗原修復及封閉后滴加一抗(α-SMA)37℃孵育1 h；滴加反應增強液,在室溫下孵育20 min,滴加酶標二抗,在室溫下孵育20 min；二氨基聯(lián)苯胺氧化氫(DAB-H2O2)顯色,自來水充分漂洗,復染、脫水、透明,封片；光鏡下觀察。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達 使用含有蛋白酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀試驗(RIPA)緩沖液進行裂解陰莖組織,行Western blot 分析。使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度,然后將蛋白進行凝膠電泳和電轉(zhuǎn),用5%脫脂奶粉封閉,并與α-SMA、GAPDH 和nNOS 的一抗孵育過夜。在室溫下與二抗孵育后顯影拍照,采用Image-Pro Plus 軟件進行分析條帶。

1.3 觀察指標 比較三組大鼠ICPmax、MAP、ICPmax/MAP、平滑肌/膠原比值、平滑肌含量及nNOS、α-SMA 表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差 ()表示,采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP比較假手術(shù)對照組和治療組ICPmax 和ICPmax/MAP 均明顯高于模型對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；三組MAP 比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 三組大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP 比較()

表1 三組大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP 比較()

注：與模型對照組比較,aP＜0.05

2.2 三組大鼠Masson's 三色染色檢測平滑肌/膠原比值比較 陰莖海綿體組織石蠟切片行Masson's 三色染色(圖1A),利用平滑肌(紅色)/膠原(綠色)比值評估陰莖組織間質(zhì)膠原沉積(圖1B)。假手術(shù)對照組和治療組平滑肌/膠原比值均高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1A 陰莖海綿體組織石蠟切片Masson's 三色染色

圖1B 三組大鼠平滑肌/膠原比值比較

2.3 三組大鼠免疫組織化學染色平滑肌含量比較 陰莖海綿體組織石蠟切片行免疫組織化學染色(圖2A),免疫組織化學染色觀察海綿體平滑肌含量(圖2B)。假手術(shù)對照組和治療組平滑肌含量高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2A 陰莖海綿體組織石蠟切片免疫組織化學染色

圖2B 三組大鼠平滑肌含量比較

2.4 三組大鼠Western blot 檢測α-SMA 表達比較假手術(shù)對照組和治療組α-SMA 表達高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 三組大鼠Western blot 檢測α-SMA 表達比較

2.5 三組大鼠Western blot 檢測nNOS 表達比較 假手術(shù)對照組和治療組nNOS 的表達均高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 三組大鼠Western blot 檢測nNOS 表達比較

3 討論

前列腺癌發(fā)病率在全球呈顯著上升趨勢［8］,而RP 是目前治療局部進展性前列腺癌最常見的方法。但即使在神經(jīng)保留手術(shù)方式出現(xiàn)后,RP 術(shù)后ED 發(fā)生率仍然很高。根據(jù)一項前列腺癌預后研究,在為期5 年的隨訪中,60%的患者在RP 術(shù)后18 個月自我報告有ED［9］。RP 術(shù)后的ED 對許多患者及其性伴侶的生活有影響極大,尤其是對于性生活活躍的相對年輕的患者而言更是如此。臨床部分外科手術(shù)也會引起術(shù)后ED。陰莖海綿體神經(jīng)是副交感神經(jīng),沿前列腺后外側(cè)走行并支配陰莖,通過控制流向陰莖海綿體組織的血液調(diào)節(jié)勃起功能。解剖學上,海綿體神經(jīng)緊鄰前列腺包膜,在前列腺癌根治性切除過程中,極易受到機械性或電、熱等損傷,進而引起術(shù)后ED［10］。有關(guān)RP 術(shù)后ED 的實驗研究,需要建立可靠的動物模型。本研究通過利用鉗夾海綿體神經(jīng)造成人為神經(jīng)損傷,模擬RP 術(shù)后相關(guān)海綿體神經(jīng)損傷過程［11］,高度類似于臨床實際手術(shù)操作,重復好,能夠滿足實驗的需求。海綿體神經(jīng)損傷后對交感神經(jīng)的拮抗作用減弱,引起陰莖海綿體平滑肌功能障礙,特別是舒張功能,這是海綿體神經(jīng)損傷術(shù)后早期出現(xiàn)ED 的關(guān)鍵原因［12］。然而,在海綿體神經(jīng)損傷后磷酸二酯酶5 型抑制劑的治療效果有限［13］,提示還存在著更深層次的原因。有研究結(jié)果表明,海綿體神經(jīng)損傷誘導的ED 可因進行性海綿體纖維化和海綿體去神經(jīng)支配而逐步進展［14］。

神經(jīng)元組織損傷后出現(xiàn)一系列代謝失調(diào),包括缺血、興奮性毒性、鈣和線粒體失調(diào),最終導致炎癥介導的繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。因此,在神經(jīng)保護方法中抗炎治療是合理的,可為新的神經(jīng)元生長提供基礎。熊果酸具有抗氧化和抗炎作用,其具有改善神經(jīng)損傷的獨特潛力。Zhang 等［15］采用大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血腦損傷模型,觀察熊果酸(25 或50 mg/kg)給藥48 h 后的作用效果,發(fā)現(xiàn)治療組細胞間粘附分子-1、Toll 樣受體4、核因子-κB、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、誘導型一氧化氮含量顯著降低。這一結(jié)果表明,抗炎及細胞凋亡抑制作用是熊果酸具有神經(jīng)保護作用的重要機制。相關(guān)研究［16］評估熊果酸對小鼠腦損傷的影響,發(fā)現(xiàn)在腦損傷誘導后24 h 實驗后經(jīng)熊果酸(50～150 mg/kg)干預,可以減少腦水腫和神經(jīng)功能障礙,顯示出明顯的神經(jīng)保護作用。相關(guān)研究［17］利用脊髓損傷小鼠模型研究了熊果酸對神經(jīng)再生的影響,發(fā)現(xiàn)熊果酸100 或200 mg/kg,1 次/d,連續(xù)治療6 周后可以促進軸突再生和運動功能的恢復。此外,熊果酸還具有抑制損傷脊髓中IL-6 和TNF-α 等促炎細胞因子生成的作用。Li 等［18］通過小鼠腦缺血的大腦中動脈閉塞模型,研究了熊果酸的神經(jīng)保護作用,發(fā)現(xiàn)熊果酸可使腦梗死面積顯著減少,同時使脂質(zhì)過氧化標記物丙二醛維持在低水平。

海綿體神經(jīng)損傷后海綿體組織內(nèi)缺氧,平滑肌細胞凋亡增加,引起組織纖維化,收縮型標記物如α-SMA、肌動蛋白等表達下降［19］。本研究通過檢測大鼠ICP 和MAP 發(fā)現(xiàn),模型對照組大鼠ICPmax/MAP明顯低于假手術(shù)對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。由此說明神經(jīng)損傷性ED 大鼠模型構(gòu)建成功。治療組ICP 高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明熊果酸對勃起功能具有改善作用。免疫組織化學及Masson's 三色染色發(fā)現(xiàn)治療組平滑肌/膠原比值高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。由此證明經(jīng)過熊果酸干預后平滑肌細胞凋亡減少,組織纖維化得到改善。通過Western blot 檢測海綿體中α-SMA的表達水平,得到相似的結(jié)果,即假手術(shù)對照組和治療組α-SMA 表達高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。由此表明熊果酸使α-SMA 表達水平上升［20］。同時,對三組nNOS 表達水平檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)過熊果酸干預后,治療組nNOS 表達水平高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

熊果酸保護陰莖海綿體組織的機制與其抗炎作用關(guān)系密切。核因子紅細胞系2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid derived 2-like 2,Nrf2)能夠加強細胞抗氧化作用,是機體抗氧化防御系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子。相關(guān)研究表明,熊果酸可使Nrf2 蛋白核易位增多、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)醌氧化還原酶及血紅素氧化酶表達增加,誘導Nrf2 和血紅素氧化酶在蛋白和mRNA 水平的核表達相結(jié)合,抑制細胞間粘附分子-1、Toll 樣受體4、核因子-κB、白細胞介素-1β、TNF-α 等的表達,提示Nrf2 信號通路是熊果酸發(fā)揮其潛在作用重要機制［15-17］。熊果酸可能是通過Nrf2信號通路作用影響海綿體神經(jīng),使勃起神經(jīng)損傷后大鼠ICP 明顯改善,陰莖海綿體組織nNOS、α-SMA 的表達水平升高,平滑肌調(diào)亡減少,進而減輕海綿體纖維化,使大鼠勃起功能得到改善。因此,熊果酸能夠通過其抗炎、抗氧化作用改善海綿體神經(jīng)損傷后大鼠陰莖海綿體平滑肌的氧化損傷和緩解組織纖維化,進而改善陰莖勃起功能,顯示熊果酸的潛在治療作用。

綜上所述,熊果酸能夠通過抑制陰莖海綿體纖維化有效改善神經(jīng)性ED 大鼠的陰莖勃起功能,而神經(jīng)保護作用及抗氧化損傷作用可能是熊果酸對神經(jīng)損傷性ED 發(fā)揮治療作用的潛在機制。但在本次研究中,主要觀察陰莖海綿體組織及其勃起功能的變化,熊果酸對海綿體神經(jīng)本身的影響尚未涉及,有待于進一步探討。