高含量ω-3多不飽和脂肪酸魚油甘油酯的制備與研究概況*

江洲

（福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點實驗室 福建天馬科技集團股份有限公司，福建 福清 350308）

深海魚油富含二十碳五烯酸（EPA）與二十二碳六烯酸（DHA）等多種ω-3多不飽和脂肪酸，是海洋生物脂質的重要組成部分，具備許多對人體有益的生理功能，在防治心腦血管疾病、促進大腦和視網(wǎng)膜形成、延緩腦的衰老及抗炎、抑制過敏反應等方面發(fā)揮重大作用，是全世界公認的高附加值的藥品、營養(yǎng)保健食品和水產(chǎn)飼料原料，市場成熟度高。近年來ω-3脂肪酸含量≥50%的魚油甘油酯型產(chǎn)品在國外面世，與普通魚油產(chǎn)品相比它具有食用安全性好、天然和生物利用率高的特性，屬于高端魚油藥品和保健品。因此，高含量ω-3多不飽和脂肪酸的甘油酯型魚油產(chǎn)品的研發(fā)和制備，不僅可以滿足魚油行業(yè)結構調整和產(chǎn)品升級需求，而且順應全球消費市場對高端魚油產(chǎn)品日益增長的需要，成為食用油脂加工業(yè)新的經(jīng)濟增長點。

1 深海魚油產(chǎn)品類型及升級

深海魚油中ω-3多不飽和脂肪酸的重要生理功能被明確后，作為食用油脂的深海魚油產(chǎn)品發(fā)展主要經(jīng)歷了三個階段。

第一個階段始于上世紀七十年代，這一階段的魚油產(chǎn)品主要是天然的甘油三酯型深海魚油。加工工藝是將魚肉蒸煮、擠壓后得到粗制魚油，再通過脫膠、脫酸、脫色和脫臭等精煉工藝獲得純化的魚油甘油三酯。其中魚油產(chǎn)品的ω-3多不飽和脂肪酸含量為15%～30%。

第二個階段始于上世紀80年代。由于化學合成技術和分離技術的發(fā)展，工業(yè)上將ω-3脂肪酸為 25%左右的魚油甘油三酯和甲醇或乙醇進行化學合成反應，生成魚油甲酯或乙酯，再經(jīng)過分子蒸餾進一步提純得到ω-3脂肪酸含40%～80%的甲酯型或者乙酯型魚油產(chǎn)品。由于該產(chǎn)品的黏度低并且ω-3 脂肪酸含量較高，因此受到消費者青睞，并逐漸占據(jù)了國內外魚油保健產(chǎn)品的主要市場。在同一時期，作為藥品的高濃縮EPA和DHA乙酯面世，例如：挪威Pronova Biocare公司研發(fā)EPA和DHA含量高達84%的多烯乙酯處方藥Omacor，主要用于治療再發(fā)性心肌梗死；日本的持田制藥研發(fā)EPA和 DHA含量高達96%的多烯乙酯處方藥Epadel，用于治療動脈硬化和高血脂[1]。

第三個階段始于上世紀 90 年代?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明乙酯型魚油在人體胃腸道內的消化吸收率低，并且對于嬰幼兒以及酒精過敏癥患者可能會存在食品安全性的潛在風險[2]，而ω-3脂肪酸的甘油酯比乙酯更容易被人體吸收，在消化道內的水解速率更高且更加安全，其功能性研究表明甘油酯型魚油的生物利用率比乙酯型魚油高70%左右[3]。另一方面，天然形式的甘油三酯型魚油的存在形式最符合配藥學規(guī)則，比如EPA的甘油三酯形式更適合用于抑制血栓的制劑[4]，甘油三酯的形式也更適合于嬰幼兒食品，因為ω-3脂肪酸在母乳中就是以甘油三酯的形式存在的[20]。因此，高含量ω-3多不飽和脂肪酸的甘油酯型魚油產(chǎn)品具有了食用安全性好、天然和生物利用率高的特性而備受關注，成為目前全球魚油產(chǎn)業(yè)新的經(jīng)濟增長點。

高含量ω-3多不飽和脂肪酸的甘油酯型魚油產(chǎn)品的經(jīng)濟附加值高，但是長期以來，我國魚油產(chǎn)品市場大都被進口產(chǎn)品占據(jù)。本地產(chǎn)品以乙酯型魚油和低含量ω-3多不飽和脂肪酸魚油為主，而同期北美、西歐、日本等地區(qū)利用生物技術生產(chǎn)的高含量ω-3多不飽和脂肪酸甘油酯型魚油已實現(xiàn)商品化，并且銷售規(guī)模不斷擴大。我國的高含量ω-3甘油酯型魚油的開發(fā)正處在初始階段，受技術和成本所限，還未形成商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，只有個別企業(yè)投入了試生產(chǎn)階段，年產(chǎn)量僅為百公斤左右，缺乏市場競爭力。受新冠疫情的影響，2020年以來歐美各國的食品級魚油生產(chǎn)受到極大影響，給我國的食品級魚油行業(yè)創(chuàng)造了良好的機會。2021年我國的食品級原料魚油的進口量超過5萬噸，比上一年進口量增加近一倍，這充分說明了食品級魚油需求旺盛。因此，應抓住機遇，加快行業(yè)結構調整和產(chǎn)品升級，適應全球市場對高含量ω-3脂肪酸的甘油酯型魚油產(chǎn)品日益增長的需求。

2 高含量ω-3脂肪酸甘油酯型魚油的制備方法

高含量ω-3脂肪酸的甘油酯型魚油產(chǎn)品是目前魚油保健品的發(fā)展趨勢，其制備工藝成為目前魚油深加工關鍵技術之一。目前，實驗室與實際生產(chǎn)中采用的制備方法有傳統(tǒng)的物理化學方法和生物技術合成法[5,6]。

2.1 低溫結晶法

低溫結晶法是在低溫條件下，根據(jù)不同類型的脂肪酸熔點不同以及在過冷有機溶劑中的溶解度差異而進行分離的一種方法，因此又被稱為冬化法或溶劑分離法。通常情況下，脂肪酸在有機溶劑中的溶解度與碳鏈長度成反比，與雙鍵數(shù)成正比[7,8]。

羅慶華等采用低溫結晶法提高鳡魚油內的EPA和DHA含量，利用乙醇為溶劑，通過正交實驗優(yōu)化，在料液比為1∶6，結晶溫度為-30 ℃，結晶時間為5 h的最佳工藝條件下對鳡魚油進行處理，得到的鳡魚油產(chǎn)物內的多不飽和脂肪酸含量提高了 25%左右，其中EPA和DHA總含量提高了4%左右[9]；張紅燕等通過低溫結晶法對金槍魚油處理后，EPA和DHA總含量由處理前的29.05%上升到32.20%[10]。

低溫結晶法的優(yōu)點在于設備簡單、投資小、操作方便安全，并且因為特殊的低溫環(huán)境，能夠使魚油中的成分得到有效保留，適用于中小規(guī)模生產(chǎn)。但該法能耗較大，有機溶劑浪費嚴重并造成污染，并且ω-3脂肪酸含量的富集程度不高，因此常作為其他方法的輔助手段來使用[11,12]。

2.2 酶法制備高含量ω-3脂肪酸甘油酯型魚油

脂肪酶技術在食用油脂工業(yè)應用已近半個世紀。脂肪酶反應的作用條件溫和、催化效率高、專一性強、產(chǎn)物易于分離，因此非常適用于容易高溫氧化的ω-3脂肪酸的加工和處理[13-17]。微生物是脂肪酶的重要來源，產(chǎn)酶菌株主要集中在根霉（Rhizopus）、曲霉（Aspergillus）、假絲酵母（Candida）、毛霉（Mucoraceae）、須霉（Phycomyces）和假單胞菌（Pseudomonas）等 65個屬的微生物[18]。脂肪酶除了能夠催化甘油酯水解外，還能夠催化酯交換、酯化、酸解以及醇解等多種反應，在深海魚油產(chǎn)品的制備生產(chǎn)中起到了關鍵作用。目前采用脂肪酶技術制備高含量ω-3脂肪酸甘油酯型魚油，脂肪酶選擇性水解法、脂肪酶酯化法和脂肪酶酯交換法是三種常用工藝路線。

2.2.1 脂肪酶水解法

大部分的脂肪酶具有Sn-1,3位置選擇性，在水解脂肪時能夠有選擇地先將Sn-1,3位的脂肪酸水解。研究表明深海魚油甘油三酯的Sn-2位通常連接EPA或者DHA等多不飽和脂肪酸，其他脂肪酸通常連接在Sn-1,3位上。因此可以利用特異性脂肪酶水解魚油，將大部分Sn-1,3位的脂肪酸水解下來，從而使甘油酯型魚油中的EPA和DHA含量得到提高。

石紅旗等人采用脂肪酶水解法提高鳀魚油內的EPA和DHA含量，以國產(chǎn)假絲酵母酶催化水解反應，經(jīng)過優(yōu)化在脂肪酶用量為300 u/g油，反應溫度為45 ℃，反應時間為12 h，油水比為0.4 mg/g 油，乳化劑為Ca(OH)2 的條件下水解鳀魚油，得到EPA和DHA分別為34.0%和13.9%的鳀魚油產(chǎn)品[19]。朱東奇等人以重組米根霉脂肪酶催化水解反應水解鳀魚油，得到產(chǎn)物魚油甘油三酯含量為39.38%，甘油二酯含量為32.09%，甘油一酯含量為2.60%，并且甘油二酯中的DHA含量達到19.70%，甘油一酯中的DHA含量達到25.20%，與未水解鳀魚油相比，DHA含量大幅提升[20]。

2.2.2 脂肪酶酯化法

脂肪酶酯化法是在脂肪酶的催化作用下，單烯脂肪酸和飽和脂肪酸會優(yōu)先與醇發(fā)生酯化反應，從而以游離脂肪酸的形式使未反應的EPA和DHA得到富集，此外，還可以通過脂肪酸與醇發(fā)生酯化反應生成甘油酯，使得EPA和DHA保留在甘油酯鏈上與其他脂肪酸分離。劉書成等人采用酶促酯化法提高黃旗金槍魚油中的EPA和DHA含量，利用Novozyme 435酶催化酶促酯化反應，經(jīng)過優(yōu)化在反應溫度為40 ℃，初始水分含量為0.5%，酶添加量為25 mg，反應時間為24 h的最優(yōu)條件下得到了甘油二酯含量為56.06%，甘油三酯為31.25%，甘油一酯為12.07%的黃旗金槍魚產(chǎn)品，其中EPA含量達到了13.49%，DHA含量達到了73.36%[21]。

2.2.3 脂肪酶酯交換法

脂肪酶酯交換法也稱為脂肪酶轉酯法，是利用具有酯交換活力的脂肪酶催化甘油酯型魚油與游離脂肪酸、短鏈醇或者另一種脂肪酸酯類發(fā)生?；粨Q反應。按照底物不同，脂肪酶轉酯法可以分為酸解反應、醇解反應和酯—酯反應三種類型。郭正霞等人采用酯交換反應制備高EPA和DHA含量的甘油酯型魚油，采用國產(chǎn)固定化假絲酵母脂肪酶催化反應，用正交實驗對反應參數(shù)進行優(yōu)化，得到了最佳的反應溫度為60 ℃，反應時間為24 h，反應底物質量比為5∶4，加酶量為80 U時，制得了EPA和DHA含量分別為33.40%和13.10%的甘油酯型魚油產(chǎn)品[22]。李金章等人用酯交換反應法制備高EPA和DHA含量的甘油酯型魚油，分別采用K酶和TL IM酶催化反應，通過正交實驗優(yōu)化得到2種酶的最適作用條件，其中K酶在反應溫度為40 ℃，加酶量為6%，反應時間為18 h，底物摩爾比為2∶1時，得到產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA總含量為45.58%；TL IM 酶在反應溫度為60 ℃，加酶量為6%，反應時間為18 h，底物摩爾比為 2∶1 時，得到產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA總含量為 42.66%[23]。

3 甘油酯型魚油產(chǎn)品的分離

通過酶法制備的甘油酯型魚油產(chǎn)品，終產(chǎn)物含有游離脂肪酸和脂肪酸甲、乙酯以及甘油等物質[24]。這些物質的存在無益于產(chǎn)品的品質，甚至還會加速產(chǎn)品的氧化變質，如游離脂肪酸會加速油脂氧化。傳統(tǒng)工業(yè)中用到的堿煉法僅能對游離脂肪酸進行去除，而伴隨著油脂工業(yè)的發(fā)展進步，誕生了諸如減壓蒸餾法和分子蒸餾法等更有效的方法，這些方法不僅能夠去除游離脂肪酸，還能夠去除脂肪酸乙酯等物質。

3.1 堿煉法去除游離脂肪酸

酯交換反應得到的產(chǎn)物魚油中含有一定量的游離脂肪酸，游離脂肪酸不僅會產(chǎn)生刺激性氣味，而且還加速中性油的水解酸敗以降低油脂的物理化學穩(wěn)定性，必須盡量除去。堿煉法是目前工業(yè)上脫除游離脂肪酸的傳統(tǒng)方法，它的原理是采用氫氧化鈉或者氫氧化鉀等強堿來中和油脂中的游離脂肪酸，所生成的皂則可以將其他雜質吸附，然后在沉降的過程中使得游離脂肪酸與中性油得到有效分離[25-27]。姚堯等人采用堿煉法脫除豬網(wǎng)油中的游離脂肪酸，通過正交實驗優(yōu)化，得到反應的最佳參數(shù)，在堿液質量分數(shù)為21%，超堿量為0.1%，堿煉時間為70 min 和堿煉初溫為45 ℃時，堿煉產(chǎn)物的酸價從6.25 mgKOH/g 降至0.12 mgKOH/g[28]。堿煉法的操作簡單、效果明顯，但是堿煉法僅能夠脫除游離脂肪酸，而對甲、乙酯型魚油和甘油等物質無法脫除，因此存在一定的局限性。

3.2 減壓蒸餾分離

減壓蒸餾法是工業(yè)上常用的分離甘油酯和脂肪酸的方法，減壓蒸餾的原理主要是依據(jù)游離脂肪酸、乙酯與甘油酯的沸點不同，并且負壓條件能夠降低物質的沸點，使其在遠低于常壓沸點的溫度下沸騰氣化，有利于降低多不飽和脂肪酸的氧化。減壓蒸餾操作簡單、普及較廣、效率較高，負壓條件使加熱溫度降低，能耗也得到降低，在油脂工業(yè)中的應用廣泛。胡永員等人采用減壓蒸餾法分離人乳脂替代品，在220～300 ℃的溫度范圍內進行分離，得到蒸餾后的人乳脂替代品中的甘油酯較蒸餾前約提高了71%，酸價為8.6 mgKOH/g[29]。

3.3 分子蒸餾分離

分子蒸餾利用不同分子在高真空的條件下有效直徑不同，其加熱逸出液面后分子運動的平均自由程不同來實現(xiàn)物質分離，是一種新型的液—液分離方法，能夠有效分離油脂等高沸點、高粘度和高熱敏性的物質。分子蒸餾具有蒸餾溫度較低、受熱時間較短、清潔環(huán)保等優(yōu)點，因此被廣泛應用于制藥、食品、化工等行業(yè)，是一種綠色高效的工業(yè)生產(chǎn)方法[30-33]。通過分子蒸餾法結合脂肪酶法生產(chǎn)ω-3脂肪酸產(chǎn)品在工業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)得到初步應用。Patricia Fregolente等人采用分子蒸餾法分離大豆油酶促酯化反應產(chǎn)物中的甘油單酯，使用離心式分子蒸餾設備，在體系壓強為24 Pa，轉速為1350 r/min，溫度為250 ℃的條件下得到純度為81%的甘油單酯[34]。María Teresa Sanz等學者采用分子蒸餾法分離沙丁魚油酶促酯交換反應產(chǎn)物中的甘油單酯，在底物比甘油∶沙丁魚油為1.5∶1，溫度為50 ℃，時間為2 h，酶添加量為5%的條件下進行酶促酯化，在體系壓強為1.0～0.3 kPa條件下采用3步分子蒸餾分離產(chǎn)物，第一步蒸餾溫度為110 ℃，進料速率為1 mL/min 的條件下除去了游離脂肪酸和甘油；第二步蒸餾溫度155 ℃，進料速率為1 mL/min 的條件下得到了純度為91%甘油單酯和5.7%的甘油二酯混合物，ω-3脂肪酸含量為31%；第三步蒸餾溫度為125 ℃，進料速率為 1 mL/min的條件下進一步提高了甘油單酯中ω-3脂肪酸的含量[35]。

4 結論

綜上所述，高含量ω-3多不飽和脂肪酸的甘油酯型魚油產(chǎn)品具有食用安全性好、天然和生物利用率高的特性，正成為食用油脂加工業(yè)新的經(jīng)濟增長點。采用脂肪酶的生物技術和分子蒸餾的分離方法可以制備ω-3多不飽和脂肪酸大于50%的甘油酯型魚油，并最大程度地減少多不飽和脂肪酸的氧化，提升產(chǎn)品的品質特性。