BerEp4聯(lián)合彈性纖維雙重染色在肺腺癌累及胸膜組織的臨床應用

蔣漢文*，賴肖芬，陳水蓮，萬里燕，張小鷹，郭明星

（1廣州市番禺區(qū)婦幼保健院病理科，廣州 511402；2廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院病理科，廣州 511400）

在診斷肺葉切除術(shù)及楔形切除術(shù)的肺癌病理標本中，不僅要在報告中注明肺腺癌組織有無累及臟層胸膜，如出現(xiàn)累及情況還需要明確腫瘤組織侵犯的層次。由于腫瘤組織發(fā)生臟層胸膜侵犯時，腫瘤細胞在胸腔內(nèi)播散概率會隨浸潤層次加深而遞增，腫瘤不再局限于肺內(nèi)，會形成腫瘤性胸水，患者預后更差，因此，腫瘤侵犯臟層胸膜成為患者預后的重要影響因素[1]。傳統(tǒng)的彈性纖維獨立染色只能觀察彈性纖維在肺組織內(nèi)的分布情況，由于腫瘤組織非特異性染色，難以觀察腺癌組織與臟層胸膜之間的關(guān)系，也難以排除胸膜組織內(nèi)間皮增生及組織細胞聚集的干擾。目前與彈性纖維聯(lián)合染色的方案有TTF-1[2]或CK-pan[3]免疫組織化學染色聯(lián)合彈性纖維染色兩種，但均有難以克服的缺點。

細胞黏附分子BerEp4具有廣譜腺上皮特異性標記，能在廣譜腺癌中表達，而且可以排除增生的間皮細胞干擾。本實驗以BerEp4聯(lián)合彈性纖維雙重染色，為肺腺癌累及胸膜組織判讀提供新的備選方案。

材料與方法

1 材料收集

收集2018年1月至2022年2月廣州市番禺區(qū)婦幼保健院病理科和廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院病理科50例肺腺癌組織蠟塊及相應的TTF-1免疫組織化學染色結(jié)果，其中TTF-1免疫組織化學染色陽性45例（陽性率90%）。

2 主要試劑

即用型鼠抗人BerEp4單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；DAB染色液（增強聚合物法）試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），包含內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、反應增強液、酶標抗小鼠/兔IgG聚合物，加強型DAB緩沖液、加強型DAB底物、DAB色原等；免疫組織化學抗原修復緩沖液（胃酶法）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；維多利亞藍彈力纖維染色液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），包含Tanake氧化劑A、Tanake氧化劑B、Tanake漂白劑、維多利亞藍彈力纖維染色液、核固紅染色液； PBS（pH7.3）粉末（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；吐溫20（天津永大）。

3 溶液配制

Tanake氧 化 劑： Tanake氧 化 劑A與25 mL Tanake氧化劑B按1:1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

DAB顯色液：配制管中加入加強型DAB緩沖液（1×）1 mL、加強型DAB底物（20×）50 μL、DAB色原（20×）50 μL，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

pH7.3 PBS：取磷酸鹽粉劑 1 袋，溶于 2000 mL蒸餾水中，加入1 mL吐溫20，混勻。

4 染色方案

HE染色：3 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，常規(guī)蘇木素和伊紅染色后梯度酒精脫水，中性樹膠封固。

彈性纖維獨立染色案：4 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，置于新配的Tanake氧化劑中室溫氧化5 min，取出自來水稍洗；置入50 mL的Tanake漂白劑中漂白2 min，直至氧化劑的顏色全脫凈后自來水沖洗5 min；用70%乙醇浸洗后置于50 mL維多利亞藍染色液中浸染24 h（加蓋）；70%乙醇快速浸洗2次，每次10 s，直至切片無顏色脫出后流水稍洗；滴加核固紅染色液覆蓋組織復染5 min，流水稍洗；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

Ber-EP4聯(lián)合彈性纖維雙重染色：采用Elivison二步法，3 μm石蠟切片65 ℃烤箱中烤片1 h后常規(guī)脫蠟至水，吸水紙吸去切片上的水分，距組織邊緣2~3 mm處用免疫組織化學筆畫圈后于PBS中浸洗1 min；甩去多余液體，滴加100 μL免疫組織化學抗原修復緩沖液（胃酶法）進行抗原修復，于37℃下孵育15 min后用PBS稍沖洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液體，加入3%過氧化氫作用10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后用PBS稍沖洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液體，加入BerEP4一抗，于37 ℃孵育60 min后用PBS稍沖洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液體，加入反應增強液于37 ℃下孵育20 min后用PBS稍沖洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液體，加入酶標抗小鼠/兔IgG聚合物于37 ℃下孵育30 min后用PBS稍沖洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液體，加入DAB顯色液至切片上，室溫下孵育5 min，自來水終止顯色，70%乙醇浸泡1 min。置于50 ml維多利亞藍染色液中浸染24 h（加蓋）；用70%乙醇快速浸洗2次，每次10 s，直至切片無顏色脫出后流水稍洗；滴加核固紅染色液覆蓋組織復染5 min，流水稍洗。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

結(jié) 果

50例肺腺癌中，非黏液型腺癌共48例（包含原位腺癌23例、微浸潤性腺癌8例、浸潤性腺癌19例），黏液型腺癌2例。BerEp4聯(lián)合彈性纖維雙重染色陽性47例（陽性率94%）。在5例TTF-1陰性表達的肺腺癌中，BerEp4聯(lián)合彈性纖維雙重染色陽性4例。

50例肺腺癌與臟層胸膜關(guān)系結(jié)果分別為：未累及臟層胸膜（PL0）42例（圖1A），突破臟層胸膜內(nèi)彈性纖維層但未突破外彈性纖維層（PL0）3例（圖1B），突破臟層胸膜外彈性纖維層但未突破間皮細胞層（PL1）3例（圖1C），突破臟層胸膜間皮細胞層（PL2）2例（圖1D），臟層胸膜局灶間皮細胞增生及組織細胞聚集（胸膜反應）（pleural reaction， PLR）1例（圖1E）。

討 論

BerEp4作為一種廣譜的腺上皮標記物，除肝細胞與胃壁細胞以外，均能表達于所有腺上皮，在間皮細胞與鱗狀上皮細胞中呈陰性表達。由于BerEp4用于腺癌診斷具有較高的特異性和敏感性[4-6]，因此常常應用于胸腔積液中查找腺癌細胞[7]，是一種理想的抗體。同理，在肺腺癌的手術(shù)標本中陽性表達時，則可排除組織細胞聚集、惡性間皮瘤、間皮細胞增生及鱗狀細胞癌等病變。與彈性纖維聯(lián)合染色能更清晰地觀察腫瘤細胞與臟層胸膜之間的關(guān)系，特別是微小癌組織累及臟層胸膜的情況。在雙重染色中，腺癌細胞被染成黃棕色，臟層胸膜的彈性纖維被維多利亞藍[8]染成藍色，而背景組織被染成紅色。這種染色方案不僅能增加腫瘤組織與腫瘤周圍組織的對比度，還提高了診斷的可靠性。

與TTF-1及CK-pan免疫組織化學染色聯(lián)合彈性纖維染色方案相同，BerEp4聯(lián)合彈性纖維雙重染色方案能解決診斷工作中的以下問題：一是協(xié)助判讀腺癌組織有無累及臟層胸膜以及浸潤深度。雙重染色能區(qū)分好腫瘤組織與臟層胸膜的4種關(guān)系（PL分期）：① 腫瘤未累及臟層胸膜，腫瘤細胞位于內(nèi)彈性纖維層下方并沒有突破（PL0）（圖1A1）。②腫瘤突破臟層胸膜內(nèi)彈性纖維層，但未突破外彈性纖維層（PL0）（圖1B1）。③腫瘤突破外彈性纖維層，但未突破間皮細胞層（PL1）（圖1C1）。④腫瘤突破間皮細胞層（PL2）（圖1D1）。在獨立染色的情況下，往往需要病理醫(yī)師反復切換HE及彈性纖維切片（圖1A2、B2、C2、D2）。而雙重染色能更清晰觀察腺癌與臟層胸膜的關(guān)系（圖1A3、B3、C3、D3）。二是協(xié)助鑒別原位腺癌與附壁生長型浸潤性肺腺癌（胸膜侵犯為附壁生長型浸潤性肺腺癌的充分條件）。對于附壁生長方式的肺腺癌，病理醫(yī)師需要仔細查找有無臟層胸膜累及。當出現(xiàn)累及時，患者預后變差，病理診斷會從原位腺癌直接躍升為附壁生長型浸潤性肺腺癌。pTNM分期也直接從原位腺癌的Tis期調(diào)整為附壁生長型浸潤性腺癌的T2期[9]，患者的預后及治療方案同時會發(fā)生明顯改變?？煽康呐K層胸膜評估顯得十分重要。三是當組織細胞在臟層胸膜下聚集時（圖1E1），組織細胞形態(tài)可呈圓形或多邊形，特別細胞核增大時和腫瘤細胞相似，難以區(qū)分，雙重染色（圖1E3）有助于排除組織細胞聚集導致的假陽性情況。四是肺內(nèi)碳塵堆積的情況十分常見，在HE染色（圖1B1）及彈性纖維染色（圖1B2）的切片中會覆蓋腺癌組織，難以觀察。而且碳塵顏色與DAB試劑顯色相似，在免疫組織化學單獨染色的切片上難以區(qū)分，影響判讀。但經(jīng)過彈性纖維染色后，碳塵被染成黑色，與雙重染色的棕褐色有明顯的區(qū)別（圖1B3）,有利于解決因碳塵淤積的漏診情況。

相比CK-pan，BerEp4免疫組織化學染色能排除以下的假陽性情況：①臟層胸膜間皮細胞反應性增生可繼發(fā)于肺部感染、非特異性炎癥或腫瘤刺激[10、11]。此時間皮細胞可表現(xiàn)為數(shù)量豐富， 形態(tài)異型，甚至出現(xiàn)核分裂或發(fā)生壞死等，難與腫瘤性病變互相鑒別[12]。因為腺癌及間皮細胞能共同表達CK-pan，導致難以鑒別臟層胸膜上CK-pan陽性的細胞是由于腺癌累及還是間皮細胞團內(nèi)陷或反應性增生所造成。②由于組織細胞具有吞噬壞死細胞的能力，如果組織細胞內(nèi)的吞噬包涵體含有細胞角蛋白的細胞碎片（如間皮細胞碎片），導致組織細胞陽性表達CK-pan[13,14]，可能會誤診為臟層胸膜侵犯。雖然未曾在胸膜組織中報道過相關(guān)個案，但這種現(xiàn)象仍讓人不安。③少數(shù)非上皮細胞（如:肌纖維母細胞、平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞）在某個分化階段過程中也能表達CK-pan。而相比TTF-1，BerEp4能廣譜表達于各種類型肺腺癌中。10%～20% 的肺腺癌TTF-1呈陰性表達[15]，由于肺腺癌患者總數(shù)非常龐大，意味不少原發(fā)性肺腺癌病例，如膠樣腺癌、黏液腺癌、腸型腺癌及涎腺型腺癌等未能獲益于TTF-1方案，而BerEp4有助于解決部分TTF-1陰性的腺癌病例，能成為TTF-1陰性情況的補充方案。另外，部分實性形態(tài)的癌因不表達TTF-1、napsin A、p40、p63及CK5/6，當黏液染色未能發(fā)現(xiàn)含黏液細胞時，將會被診斷為肺大細胞癌。而BerEp4可能會成為鑒別TTF-1陰性的實體型肺腺癌與非角化性鱗狀細胞癌的潛在標記物。

BerEp4免疫組織化學方案具有以下缺點：①由于BerEp4表達譜較廣，對于轉(zhuǎn)移性腺癌也會出現(xiàn)陽性表達的可能。但大部分肺腺癌具有特征性的生長方式，與轉(zhuǎn)移性腺癌不同，而且可結(jié)合臨床及影像學提供的資料排除轉(zhuǎn)移性腺癌。②BerEp4方案對制片技術(shù)要求較高，修復時需要滴加胃酶進行修復，這個過程必須要把溫度、濃度及時間控制得十分精準，無疑增加了BerEp4染色的不穩(wěn)定性。因此在眾多實驗室中的數(shù)據(jù)差異性大，容易出現(xiàn)假陰性可能，有時候需要重復實驗才能獲得較為滿意的效果。

隨著病理技術(shù)進步和病理診斷精細化，雙重方案有助于減少病理診斷的疑難，成為病理診斷的發(fā)展方向。BerEp4免疫組織化學方案彌補了TTF-1及CK-pan免疫組織化學方案的局限性，成為肺腺癌雙重染色方案的重要補充。