甲基化修飾與膠質(zhì)瘤

張旭，曾智，熊曉星*

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院1神經(jīng)外科，2病理科，武漢 430060）

膠質(zhì)瘤是一類生物學(xué)和臨床特征復(fù)雜的異質(zhì)性腦腫瘤，惡性程度高、預(yù)后差[1]。外科手術(shù)聯(lián)合替莫唑胺（temozolomide, TMZ）化療及病變區(qū)放療是目前臨床常用的治療方式，但綜合治療效果不理想，急需進(jìn)一步探究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并開發(fā)新的治療方式[2-4]。甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)修飾的一種，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定與表達(dá)。研究表明，遺傳分子的甲基化修飾參與多種腫瘤相關(guān)通路的調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白質(zhì)均可受甲基化調(diào)控，其具體機(jī)制及其對(duì)膠質(zhì)瘤的影響還需更深層的探究[5]。本文對(duì)甲基化修飾在腫瘤細(xì)胞內(nèi)對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)的機(jī)制、該表觀遺傳學(xué)修飾方式對(duì)膠質(zhì)瘤的影響及其臨床治療應(yīng)用前景展開綜述。

1 甲基化的調(diào)節(jié)機(jī)制

DNA、RNA及組蛋白共同組成生物遺傳大分子，其保守甲基化有助于維持基因復(fù)制、修復(fù)及表達(dá)的穩(wěn)定，甲基化模式的改變對(duì)細(xì)胞的分化與發(fā)展有很大的影響。多種甲基化及去甲基化的酶構(gòu)成了多樣的通路，互相影響，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的甲基化進(jìn)行動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)[6]。

1.1 DNA甲基化

DNA 甲基化主要發(fā)生在回文CpG二核苷酸上，哺乳動(dòng)物體內(nèi)70%～80%的CpG位點(diǎn)由甲基化修飾[7]。DNA上富含CpG位點(diǎn)的區(qū)域，被稱為CpG島，大量位于基因5’端的啟動(dòng)子區(qū)域。增強(qiáng)子、沉默子等基因表達(dá)元件也富含CpG位點(diǎn)[8]。5-甲基腺苷（5-mc）的合成是DNA甲基化調(diào)控最常見的機(jī)制，在該過程中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases, DNMT），主要是DNMT1，DNMT3A等，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)為甲基供體，將甲基基團(tuán)結(jié)合到回文CpG二核苷酸的胞嘧啶的第五位碳原子上[9,10]。另一方面，10-11易位（TET）加雙氧酶（ten-eleven translocation (TET)dioxygenases）氧化DNA上修飾的甲基，主導(dǎo)DNA的去甲基化[11]。細(xì)胞通過對(duì)甲基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移與氧化，動(dòng)態(tài)調(diào)整DNA甲基化過程。

1.2 RNA甲基化

甲基化是真核生物中最常見的 RNA 修飾方式。作為細(xì)胞遺傳信息傳遞的信使，mRNA甲基化機(jī)制的研究也正在深入開展[12]。N6-甲基腺苷（m6A）的合成是mRNA修飾的主要方式，這種方式所調(diào)控的基因參與細(xì)胞分化、腫瘤進(jìn)展等生物學(xué)過程。m6A mapping及Mazter-Seq等技術(shù)展示了甲基化修飾過程中被修飾的RNA鏈上的大量m6A結(jié)合位點(diǎn)，為揭示mRNA甲基化機(jī)制提供了巨大幫助[13]。在細(xì)胞核內(nèi)，mRNA轉(zhuǎn)錄形成后，m6A的合成與消除就同時(shí)動(dòng)態(tài)地發(fā)生著。甲基轉(zhuǎn)移樣酶3（methyltransferase-like 3, METTL3）是合成反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，與其異構(gòu)適配體METTL14形成的異二聚體復(fù)合物合成mRNA上幾乎所有的m6A。m6A結(jié)合細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中含有YDH片段的蛋白，如YDHDC1，YDHDC2，YDHDF，維持mRNA的穩(wěn)定及調(diào)控其剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過程。另一方面，細(xì)胞內(nèi)脂肪團(tuán)與肥胖相關(guān)基因（fat mass and obesity-associated gene, FTO）及去甲基化酶AlkB同族體5（AlkB Homolog 5, ALKBH5）具有消除RNA甲基化的作用，進(jìn)而降低m6A修飾的mRNA的穩(wěn)定性[12]。

1.3 組蛋白甲基化

組蛋白與DNA組成共同核小體，組蛋白不僅起到維持DNA雙螺旋的作用，還是協(xié)調(diào)染色質(zhì)外部調(diào)節(jié)可及性的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。組成核小體的組蛋白包括H2A，H2B，H3，H4，其中對(duì)H3甲基化的研究最廣泛[14]。組蛋白氨基酸旁鏈的賴氨酸與精氨酸的N末端，是包括甲基化、乙?；胺核鼗趦?nèi)的多種轉(zhuǎn)錄后修飾的發(fā)生位置。賴氨酸（K）是組蛋白翻譯后甲基化的主要基團(tuán)，可以結(jié)合多個(gè)甲基基團(tuán)，形成單甲基化、雙甲基化或三甲基化，而精氨酸（R）可以形成單甲基化及對(duì)稱或非對(duì)稱的二甲基化[5]。組蛋白H3K9、H3K27和 H4K20甲基化往往預(yù)實(shí)著染色質(zhì)構(gòu)象封閉和基因沉默；相反，H3K4、H3K36和 H3K79甲基化則預(yù)示著染色質(zhì)構(gòu)象開放和基因表達(dá)[15]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferases,HMTs）是組蛋白甲基化的主要酶，包括EZH2、G9a、MLL1等，催化不同形式的組蛋白甲基化。細(xì)胞內(nèi)也有組蛋白去甲基化酶（histone demethylases,HDMs）催化甲基化的組蛋白去甲基化，所以組蛋白的甲基化也是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程[16]。

1.4 甲基化調(diào)節(jié)的整體特點(diǎn)

甲基化與去甲基化的過程在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)發(fā)生。近年來發(fā)現(xiàn)了一些可以酶促不同種類分子甲基化過程的酶及復(fù)合酶體，例如人核仁蛋白1（human nucleolar protein 1）能同時(shí)催化RNA及組蛋白的甲基化[17]，DNMT2能同時(shí)催化DNA和RNA[18]。甲基供體SAM給出甲基后，產(chǎn)物s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosylhomocysteine, SAH）會(huì)轉(zhuǎn)而抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，令甲基化成為一個(gè)具有負(fù)反饋、自限性的調(diào)控過程[5]。以上現(xiàn)象都表明，甲基化是整體而動(dòng)態(tài)的調(diào)控過程，其機(jī)制在疾病的治療中具有應(yīng)用潛力。

2 甲基化在膠質(zhì)瘤中的作用

甲基化失衡是大部分惡性腫瘤的特征之一，諸多研究揭示了甲基化調(diào)控的異常在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展與預(yù)后中扮演重要角色。作為表觀遺傳學(xué)的一種，甲基化可遺傳可調(diào)控，其關(guān)鍵機(jī)制也在近年來的研究中被當(dāng)作膠質(zhì)瘤治療的可能靶點(diǎn)[19,20]。

2.1 DNA甲基化與膠質(zhì)瘤

CpG島甲基化表型：CpG島是DNA甲基化的主要位置，CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotype, CIMP）指基因組層面CpG島過甲基化，是包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的預(yù)后指標(biāo)[21]。研究顯示CIMP+的膠質(zhì)瘤亞型主要出現(xiàn)在低級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本中，而且這種高甲基化表型的膠質(zhì)瘤患者具有更好的預(yù)后[22,23]。也有研究顯示，CIMP含量豐富的膠質(zhì)瘤隨著腫瘤的進(jìn)展、惡化，其內(nèi)部的CIMP含量會(huì)降低進(jìn)而表現(xiàn)出CIMP較低的表型[24]。

MGMT 啟動(dòng)子甲基化：在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，內(nèi)源性的DNA 甲基化對(duì)膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥TMZ的反應(yīng)有重大影響。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）可以修復(fù)TMZ等烷基化藥物導(dǎo)致的DNA破壞[25]，其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，阻止轉(zhuǎn)錄因子于MGMT酶啟動(dòng)子區(qū)域的作用，可實(shí)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)沉默，進(jìn)而增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)化療的敏感性，改善預(yù)后[26,27]。有臨床研究顯示MGMT 啟動(dòng)子甲基化是放化療后膠質(zhì)瘤獨(dú)立預(yù)后因素[28]，也可以用于預(yù)測(cè) GBM 治療中替莫唑胺等烷化劑的副作用。

2.2 RNA甲基化與膠質(zhì)瘤

m6A修飾：m6A甲基化修飾是目前膠質(zhì)瘤領(lǐng)域RNA修飾研究的熱點(diǎn)，而其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到的作用尚存爭(zhēng)議[29]。有研究表明膠質(zhì)瘤組織中m6A水平降低，通過過表達(dá)關(guān)鍵酶METTL3來增加m6A水平可以有效抑制細(xì)胞的增殖與遷移能力并加強(qiáng)細(xì)胞的凋亡[30]。但是另有研究表明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體外分化后，細(xì)胞內(nèi)m6A水平下降，且分化后的細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)降低[31]。Wilms腫瘤相關(guān)蛋白（WTAP）與METTL3-METTL14復(fù)合體共同發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移的作用，是m6A甲基化的重要參與蛋白[12]，而有研究表明在惡性膠質(zhì)瘤組織中WTAP的高表達(dá)往往預(yù)示著患者更差的預(yù)后[32]。膠質(zhì)瘤中m6A修飾程度及其作用尚未得出定論，m6A在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中不同階段起到的作用可能截然不同，仍需進(jìn)一步研究[33]。

2.3 組蛋白甲基化與膠質(zhì)瘤

組蛋白編碼基因突變：編碼組蛋白的基因突變，使合成的組蛋白尾端受調(diào)控的氨基酸發(fā)生改變，進(jìn)而影響組蛋白相關(guān)修飾的讀取與寫入[34]。組蛋白H3.3突變?cè)谀[瘤領(lǐng)域被廣泛研究，這類突變引發(fā)染色質(zhì)調(diào)控的紊亂，進(jìn)而影響癌癥[14]。H3K27M突變是賴氨酸到甲硫氨酸的突變體，擾亂特定賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的靶位點(diǎn)進(jìn)而影響甲基化，H3K27M與多梳抑制復(fù)合體（Polycomb Repressive Complex 2，PRC2）上具有催化作用的亞單元EZH2結(jié)合，抑制PRC2促進(jìn)H3K27甲基化的作用，降低細(xì)胞內(nèi)整體的H3K27甲基化水平[14,35]。此突變是包括彌漫性內(nèi)源性腦橋膠質(zhì)瘤（diffuse intrinsic pontine glioma, DIPG）在內(nèi)的中線小兒高級(jí)別膠質(zhì)瘤特有的突變[36]，對(duì)DIPG的研究顯示突變與PI3K及TP53等癌癥相關(guān)通路有關(guān)[36]，H3K27M突變的患者相比無此種突變的患者預(yù)后更差[38]。WHO也已經(jīng)將具有H3K27M突變的膠質(zhì)瘤單獨(dú)分類[39]。

組蛋白甲基化調(diào)節(jié)酶：HMTs和HDMTs 都在腫瘤的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且都是抗癌治療的潛在靶點(diǎn)[40]。包括MLL1、PRMT1、EZH2和G9a在內(nèi)的多種組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中組蛋白賴氨酸的甲基化水平[41]。EZH2在膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，與膠質(zhì)瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移與侵襲均有關(guān)[42]，實(shí)驗(yàn)研究顯示，EZH2調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡、自噬、細(xì)胞周期等相關(guān)機(jī)制及線粒體膜電位，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，減少其表達(dá)可以有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[43]，臨床研究顯示EZH2表達(dá)較高的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存更差[42,44]。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases,PRMTs）是將甲基添加到目標(biāo)精氨酸殘基上的關(guān)鍵酶，有研究表明PRMT1和PRMT5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和組織中高表達(dá)，對(duì)患者的生存有負(fù)面影響，降低這兩個(gè)基因的表達(dá)可以抑制動(dòng)物模型上移植瘤的生長(zhǎng)[45]。

2.4 基于甲基化機(jī)制膠質(zhì)瘤治療展望

關(guān)于表觀遺傳學(xué)治療的臨床試驗(yàn)已經(jīng)廣為開展，其中一些已經(jīng)得到批準(zhǔn)而在臨床實(shí)踐中試行。基于甲基化相關(guān)機(jī)制的干預(yù)方式也處于探索當(dāng)中，這些干預(yù)方法旨在恢復(fù)在這些疾病中觀察到的甲基化失衡[46]。

DNMT抑制劑與DNA去甲基化藥物，如氮雜胞苷（azacytidine, AZA）、地西他濱（decitabine,DAB），是胞苷類似物，其與DNA結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)DNMT結(jié)合位點(diǎn)并促進(jìn)其降解，抑制DNA甲基化，使平衡向去甲基化移動(dòng)，進(jìn)而激活一些抑癌基因的表達(dá)[47]。有研究表明，AZA和DAC對(duì)患者來源的移植膠質(zhì)瘤模型有較強(qiáng)的抑制作用，即使后期停止給藥，腫瘤也沒有再生[47]。PRMT5抑制劑GSK591和LLY-283在體外被證實(shí)可以抑制46個(gè)患者來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，該研究表明，PRMT5 抑制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組剪接的廣泛破壞，特別是抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因產(chǎn)物。LLY-38是具有腦滲透性的PRMT5抑制劑，能顯著延長(zhǎng)腫瘤原位移植小鼠的存活時(shí)間[48]。針對(duì)RNA m6A甲基化進(jìn)行調(diào)控的治療手段也在研發(fā)當(dāng)中，一些含哌嗪環(huán)的化合物可以有效地與METTL3-METTL14復(fù)合物結(jié)合，促進(jìn)RNA甲基化[49]。有研究顯示METTL3的小分子抑制劑可以抑制急性髓系白血病[33]。相信不久之后相關(guān)的技術(shù)也將應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的治療。

3 小結(jié)

甲基化在膠質(zhì)瘤中的作用，隨著對(duì)其機(jī)制的研究越來越深入而逐漸受到重視。目前對(duì)甲基化機(jī)制的了解，還處于探索階段，研究已表明，甲基化與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、臨床分類、治療與預(yù)后均有密切的聯(lián)系，而針對(duì)甲基化機(jī)制開展的腫瘤治療方法研究也已處于探索階段?？梢灶A(yù)見，調(diào)節(jié)甲基化調(diào)控中關(guān)鍵的路徑將會(huì)成為治療膠質(zhì)瘤的一種可靠方法。