泛素特異性蛋白酶2促進(jìn)心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展的作用△

高偉年，趙曙光，郭 娜，陳子英，張文立，閆 芳

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟大血管外科，石家莊 050000；2.石家莊市中醫(yī)院心病一科，石家莊 050051）

心臟主要由心肌細(xì)胞，非心肌細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）以及細(xì)胞外基質(zhì)組成［1-2］。心肌肥厚是常見的心臟病理表現(xiàn)，長期心肌肥厚最終會導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生［3-4］。心肌肥厚是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，雖然目前發(fā)現(xiàn)許多生物學(xué)過程都與心肌肥厚的發(fā)展密切相關(guān)［5-6］，但是心肌肥厚發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。泛素特異性蛋白酶2（ubiquitin specific protease 2，USP2）是去泛素化酶家族中的重要一員，所編碼的蛋白活性對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）信號通路的持續(xù)激活是必須［7-8］。已有研究表明，USP2可與脂肪酸合酶（FAS，抑制細(xì)胞凋亡蛋白），小鼠雙微體基因（MDM2），細(xì)胞周期蛋白D1等蛋白相互結(jié)合，并使這些蛋白去泛素化從而抑制其降解［9-11］。已有研究表明，USP2可以與心肌細(xì)胞膜上的鈣通道蛋白KCNQ1相互結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌節(jié)律［12］。但直到目前為止，USP2在心肌肥厚中的作用尚不清楚，因此，本研究旨在研究USP2在心肌肥厚中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

無特定病原體（SPF）級的C57BL/6雄性小鼠10只，鼠齡9～11周，體質(zhì)量22～25 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（SCXK（京）-2018-004）。無特定病原體級Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，出生時(shí)間為72 h，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（SCXK（冀）-2018-004）。無菌手術(shù)在河北省實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行［SYXK（冀）2018-008］。實(shí)驗(yàn)過程對實(shí)驗(yàn)動物按照3R原則給與人道的關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)試劑：異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）（濟(jì)南科匯藥業(yè)有限公司），干擾USP2腺病毒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生物），SuperReal熒光定量預(yù)混試劑（北京天根生物），極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京天根生物），RIPA Lysis and Extraction Buffer（美國賽默飛），蛋白酶抑制劑（美國賽默飛），TRIzol（美國賽默飛），磷酸酶抑制劑（美國賽默飛），USP2鼠抗人單克隆抗體（上海艾博抗），GAPDH鼠抗人單克隆抗體（上海艾博抗），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（上海碧云天）。

1.2 主要儀器

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Bio-Rad），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf），冷凍冷藏兩用冰箱（中國海爾），-80℃超低溫冰箱（美國賽默飛），轉(zhuǎn)膜儀（北京六一），電泳儀（北京六一）。

1.3 異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型的建立

實(shí)驗(yàn)分為心肌肥厚組及對照組。將配置好的ISO（8.7 mg·kg-1·d-1）注入滲透壓微泵，放置于心肌肥厚組小鼠背部皮下，持續(xù)處理7 d。對照組小鼠持續(xù)給予0.9%氯化鈉溶液處理7 d。

1.4 分離大鼠原代心肌細(xì)胞

根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］，取新生乳大鼠心臟，眼科剪將心臟剪成小碎塊，0.2%胰蛋白酶中重復(fù)消化，1 200 r/min離心，15%胎牛血清的DMEM（Dulbecco Eagle's minimum essential medium）培養(yǎng)基懸浮沉淀，300目網(wǎng)過濾，預(yù)貼壁1 h后，將上清重新轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中。

1.5 ShRNA腺病毒感染

將USP2干擾及其對照腺病毒加入原代心肌細(xì)胞中，感染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。USP2干擾序列為：5'-GGAGGCAGTGGATTTCCTTAT-3'，對照干擾序列為：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。

1.6 熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA。PCR擴(kuò)增檢測目的基因mRNA的表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參基因，分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。本研究中所用引物如表1所示。

表1 本研究中所用引物

1.7 Western blot檢測方法

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液RIPA（radio immunoprecipitation assay）冰上裂解20 min。4℃，12 000 r/min離心15 min后收集上清。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗和二抗孵育，顯影。

1.8 細(xì)胞面積的計(jì)算

原代心肌細(xì)胞使用α-actinin免疫熒光染色后，Image J軟件分析心肌細(xì)胞的面積。每組隨機(jī)測量10個(gè)細(xì)胞計(jì)算面積，取均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌肥厚模型建立的檢測結(jié)果

與對照組相比，ISO處理后的小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值顯著升高（圖1A），可見ISO誘導(dǎo)的小鼠心臟質(zhì)量增加，發(fā)生心肌肥厚。熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測心肌肥厚關(guān)鍵基因表達(dá)水平的結(jié)果顯示，與對照組相比，ISO處理組心臟組織中ANP（t=27.11，P＜0.001）、BNP（t=17.75，P＜0.001）及MYH7（t=15.34，P＜0.001）基因的mRNA水平顯著增加（圖1B）。說明小鼠心肌肥厚模型建立成功［14］。

2.2 對照組與異丙腎上腺素處理組小鼠泛素特異性蛋白酶2表達(dá)比較

與對照組小鼠比較，ISO處理組小鼠的USP2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，t=5.83，P＜0.01）。

2.3 對照組和干擾組大鼠泛素特異性蛋白酶2基因mRNA及蛋白表達(dá)量比較

腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對USP2基因的干擾效果如圖3所示，與對照組大鼠比較，USP2干擾組大鼠USP2基因mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.53，P＜0.001）。

2.4 干擾泛素特異性蛋白酶2的表達(dá)抑制異丙腎上腺素引起的心肌肥厚反應(yīng)

在ISO刺激的原代心肌細(xì)胞中，抑制USP2的表達(dá)可以顯著減小心肌細(xì)胞的面積（圖4A，AdshCtrl PBSvs.ISO，t=32.23，P＜0.001；ISO Ad-shCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=24.23，P＜0.001），同時(shí)也可以抑制ISO上調(diào)的心肌肥厚標(biāo)志基因ANP（圖4B，Ad-shCtrl PBSvs.ISO，t=21.42，P＜0.001；ISO AdshCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=14.56，P＜0.001）和BNP（圖4C，Ad-shCtrl PBSvs.ISO，t=22.67，P＜0.001；

圖1 對照組與ISO處理組小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值及ANP，BNP和MYH7表達(dá)的比較（A：對照組與ISO處理組小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值比較；B：對照組與ISO處理組小鼠qRT-PCR檢測的ANP，BNP和MYH7表達(dá)比較）

圖2 對照組與ISO處理組小鼠USP2表達(dá)的比較（A：對照組與ISO處理組小鼠qRT-PCR檢測USP2的mRNA表達(dá)量比較；B：對照組和ISO處理組小鼠Western blotting檢測的USP2蛋白表達(dá)量比較）

圖3 對照組和USP2干擾組大鼠USP2基因mRNA及蛋白表達(dá)量比較（A：對照組和USP2干擾組大鼠qRT-PCR檢測的USP2 mRNA表達(dá)量比較；B：對照組和USP2干擾組大鼠Western blotting檢測USP2的蛋白表達(dá)量比較）

ISO Ad-shCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=18.62，P＜0.001）基因表達(dá)。在對照組中干擾USP2的表達(dá)對細(xì)胞大小，ANP、BNP及MYH7基因的表達(dá)并無顯著影響。這些結(jié)果表明干擾USP2的表達(dá)能夠顯著抑制ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚反應(yīng)。

3 討論

圖4 干擾USP2可以抑制心肌肥厚的發(fā)生（A：干擾USP2可以顯著抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大；B：干擾USP2可以顯著抑制ISO誘導(dǎo)的ANP基因的上調(diào)；C：干擾USP2可以顯著抑制ISO誘導(dǎo)的BNP基因的上調(diào)）

心肌肥厚是心肌細(xì)胞應(yīng)對內(nèi)外刺激而增加心臟泵血功能和減少心室壁張力的一種適應(yīng)性生長［15-16］。心肌肥厚包括生理性肥厚和病理性肥厚，雖然兩者均表現(xiàn)為心臟大小的增加，但是病理性肥厚伴隨心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積導(dǎo)致心肌纖維化，心臟功能障礙和心力衰竭乃至猝死風(fēng)險(xiǎn)的增加［17-18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，USP2在ISO誘導(dǎo)的肥厚小鼠中的表達(dá)顯著增加，用腺病毒敲低USP2的表達(dá)能夠抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞大小，抑制ISO誘導(dǎo)的肥厚基因的表達(dá)。心肌肥厚過程中會發(fā)生蛋白合成的增加和基因表達(dá)模式的改變。心肌肥厚過程中胚胎期基因，包括ANP，β-肌球蛋白重鏈等，表達(dá)顯著增加。同時(shí)心肌肥厚過程中也會伴隨著一些蛋白表達(dá)水平的下調(diào)。本研究使用ANP，BNP和MYH7作為判斷心肌肥厚的基因指標(biāo)，ISO誘導(dǎo)可以促進(jìn)上述3種基因的表達(dá)水平顯著升高，而干擾USP2可以抑制ISO對上述3種基因的誘導(dǎo)作用，提示USP2參與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展。

USP2定位于人的11q23.3號染色體上，共有17個(gè)外顯子。USP2基因可以產(chǎn)生7個(gè)選擇性剪接變體，其中5個(gè)可以編碼蛋白［19］。已有研究表明，USP2可與多種蛋白相互作用并對其進(jìn)行去泛素化，影響蛋白的穩(wěn)定性；例如USP2可以與脂肪酸合成酶相互作用，從而促進(jìn)脂肪酸合酶的半衰期，穩(wěn)定脂肪酸合酶［9］，而沉默USP2導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20］。而作為機(jī)體耗能最多的一個(gè)器官，心肌肥厚過程中心肌代謝模式發(fā)生轉(zhuǎn)變，脂肪酸利用減少，葡萄糖攝取及糖酵解增加［21］，因此干擾USP2可能通過降低脂肪酸合酶的穩(wěn)定性，降低心肌脂肪酸的合成，從而參與心肌肥厚過程中心肌的代謝方式。心肌細(xì)胞肥厚過程中，心肌細(xì)胞會發(fā)生凋亡和壞死，由于絕大多數(shù)的心肌細(xì)胞在出生后就失去增殖能力，死亡的心肌細(xì)胞會由大量的細(xì)胞外基質(zhì)替代［22］，過量的細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致瘢痕或纖維化的形成，最終導(dǎo)致心律失常［23］。已有研究表明，USP2可以與心肌細(xì)胞膜上的鈣通道蛋白KCNQ1相互結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞節(jié)律［12］，提示USP2可能通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞節(jié)律參與心肌肥厚的發(fā)生。雖然本研究發(fā)現(xiàn)USP2參與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展，但USP2如何發(fā)揮功能尚待進(jìn)一步探討。USP2作為去泛素蛋白酶家族成員，是否通過調(diào)控上述蛋白穩(wěn)定性或者調(diào)節(jié)其他靶蛋白的泛素化發(fā)揮功能尚待進(jìn)一步探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ISO誘導(dǎo)心肌肥厚過程中，USP2表達(dá)上升，靶向敲低USP2可以有效的抑制ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚。但USP2參與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展的詳細(xì)作用機(jī)制有待深入研究。心肌肥厚的發(fā)生與多種因素有關(guān)，但機(jī)制尚不清楚。目前，對于心肌肥厚導(dǎo)致的心力衰竭臨床上缺乏高效的防治方法。因此，本研究將為防治心肌肥厚以及心肌肥厚所致的心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)室工作基礎(chǔ)和理論依據(jù)，并為防治心力衰竭提供新的藥物作用靶點(diǎn)。