串聯(lián)固相萃取柱凈化法提取辣椒醬中的蘇丹紅

宋曉婉，鐘亞安，宋旭鳳，代真真，梁先龍

(安徽中青檢驗檢測有限公司，安徽合肥 230088)

蘇丹紅染料是一種人工合成的以苯基偶氮萘酚為主要基團的親脂性偶氮化合物，蘇丹紅 I 化學(xué)名稱為1-苯基偶氮-2-萘酚，蘇丹紅 Ⅱ 化學(xué)名稱為 1-[(2，4-二甲基苯)偶氮]-2-萘酚，蘇丹紅 Ⅲ 化學(xué)名稱為 1-[4-(苯基偶氮)苯基]偶氮-2-萘酚，蘇丹紅 IV 化學(xué)名稱為1-2-甲基-4-[(2-甲基苯)偶氮]苯基偶氮-2-萘酚，因蘇丹紅類物質(zhì)含有氮氮雙鍵(偶氮基)，即結(jié)構(gòu)式中的—N==N—，與連接在其兩端的苯環(huán)一起構(gòu)成發(fā)色基團，偶氮基與芳香結(jié)構(gòu)構(gòu)成的偶氮苯大共軛體系能夠吸收一定波長的可見光，故含有偶氮苯體系的物質(zhì)能顯現(xiàn)出一定的顏色使其外觀為暗紅色或深黃色片狀體，主要用于石油、機油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。經(jīng)研究表明，蘇丹紅具有致突變和致癌性[1-2]，我國和歐盟都禁止用于食品中，但仍有一些不法分子在利益驅(qū)使下，在飼料中加入蘇丹紅染料，家禽食入體內(nèi)后得到好看的“紅黃蛋”。

目前，食品中蘇丹紅的檢測方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法[3-6]、液相色譜質(zhì)譜法[7-11]、液相色譜法[12-13]、薄層色譜法[14-15]等，而國內(nèi)已熟知蘇丹紅的檢測方法為 GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》[16]，國標法中用氧化鋁小柱凈化樣品，采用液相色譜法檢測食品中的蘇丹紅，該方法操作煩瑣、結(jié)果重現(xiàn)性差，且針對基質(zhì)復(fù)雜樣品不能較好地去除樣品中的雜質(zhì)。張鑫等[17]解決了國標中的中性氧化鋁固相萃取柱手工填裝且不容易把握填裝量的困難，通過對不同填料量的市售中性氧化鋁固相萃取柱進行比較，選擇了其中一款500 mg/6 mL 的中性氧化鋁固相萃取柱，但是對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，凈化效果不好，基質(zhì)干擾較多，回收率較低，且依然存在氧化鋁活度難以掌控的問題。程曉宏等[12]利用分子印跡固相萃取小柱能選擇性地識別和富集蘇丹紅染料，正己烷淋洗樣品中油性雜質(zhì)，二氯甲烷洗脫蘇丹紅染料的原理提取樣品中的蘇丹紅，但是對于油脂較多的辣椒醬來說，仍然存在富集液體顏色深、基質(zhì)干擾大的困擾。根據(jù)蘇丹紅具有親脂性的化學(xué)性質(zhì)，筆者嘗試采用以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PSD)和N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯(HLB)這2種聚合物基質(zhì)為串聯(lián)固相萃取柱填料代替氧化鋁作為固相萃取材料來凈化樣品，選擇合適的淋洗液和洗脫液，同時優(yōu)化樣品前處理條件，達到快速、高效、準確地測定樣品中蘇丹紅含量 。

1 材料與方法

1.1 儀器液相色譜儀，美國 Thermo fisher公司；JK-500型超聲波清洗器，TGL-16M 離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；G560E 渦旋混勻器，上海佳能電子科技有限公司；十萬分之一、萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司。HSC-24B氮氣吹干儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；蘇丹紅專用柱、PSD固相萃取柱、HLB固相萃取柱，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ標準品來源為 Dr.Ehrenstorfer.，以上標準品純度均為99.0%；乙醚、乙腈、甲酸、正己烷、丙酮、乙酸乙酯均為色譜純，德國Merck公司；一級水，由超純水系統(tǒng)制備。

1.3 標準儲備液的配制準確稱取蘇丹紅Ⅰ ～ Ⅳ標準品，用乙醚溶解后，用色譜級丙酮配制成 0.1 mg/mL 的儲備液，臨用時再用丙酮稀釋成不同濃度的混合標準溶液，4 ℃下避光保存。

1.4 液相色譜條件色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6 mm × 150 mm，3.5 μm)；流動相為乙腈(A)∶水(B)(90∶10，v/v)，等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長分別為蘇丹紅Ⅰ 478 nm、蘇丹紅Ⅱ 520 nm、蘇丹紅Ⅲ 520 nm、蘇丹紅Ⅳ 520 nm；進樣量10 μL。

1.5 樣品前處理準確稱取 2.000 g(精確至 0.001 g)試樣于離心管中，加入 10 mL 正己烷，渦旋混勻 1 min，超聲提取 5 min，以5 000 r /min 的速度離心 3 min，移出上清液，下層固體再用 5 mL 正己烷提取 2次，合并提取液。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL左右后加入用正己烷活化過的PSD柱和HLB柱的串聯(lián)柱中，以 3 mL 正己烷淋洗2次，棄去淋洗液，去掉上面的PSD柱，并抽干下面的HLB柱，最后用 5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀 于45 ℃下氮吹至近干。用 1 mL 乙腈溶解定容，渦旋 10 s 后過 0.22 μm 有機濾膜，供液相色譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法國標方法中采用正己烷-丙酮提取，中性氧化鋁為吸附劑進行凈化，過程煩瑣，試劑消耗量大，且對中性氧化鋁活度難以控制。目前市面上出現(xiàn)多種蘇丹紅專用小柱，在進行多家比對試驗后發(fā)現(xiàn)在處理辣椒醬、辣椒油等基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品時，仍然出現(xiàn)洗脫液顏色較深、雜峰較多、基質(zhì)效應(yīng)依然存在等問題。該試驗中對于高含量油脂的辣椒醬首先采用正己烷進行提取，渦旋超聲增加提取效率，然后將提取液加入去油脂和蘇丹紅富集的串聯(lián)柱中，樣品通過去除油脂后被富集至下層小柱，再用洗脫液進行收集。

2.2 色譜條件及標準溶液稀釋液的優(yōu)化國標方法中用0.1%甲酸水、乙腈、丙酮作為流動相，4 種蘇丹紅在色譜柱中均可以達到分離效果，但是比較煩瑣，該試驗采取乙腈和水作為流動相，在試驗中嘗試調(diào)整流動相乙腈和水的比例為100∶0、95∶5和90∶10時，發(fā)現(xiàn)4種蘇丹紅在90∶10時均能達到很好的分離效果。因為液相色譜方法是反向色譜法，流動相中含有水，在用國標方法正己烷作為標準溶液定容液體時，正己烷與水不互溶導(dǎo)致色譜峰形不理想，該試驗嘗試采用丙酮定容，峰形改善效果明顯。

2.3 洗脫液的選擇購買基質(zhì)比較復(fù)雜的辣椒醬陽性樣品，采用串聯(lián)柱凈化的方法，研究丙酮-正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯3種不同洗脫溶劑對4種蘇丹紅的洗脫能力。由圖1可見，不同洗脫溶劑對蘇丹紅Ⅲ的效果無明顯變化，但蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅳ通過丙酮-正己烷的洗脫效果均為最差，而乙酸乙酯對4 種蘇丹紅的洗脫效果均是最好的，且乙酸乙酯的毒性相對較小。

圖1 不同溶劑洗脫效率的比較Fig.1 Comparison of elution efficiency of different solvents

2.4 凈化方式的選擇因為正己烷的極性很低，對油脂類物質(zhì)也有很好的溶解性，在使用正己烷作為提取劑提取樣品中蘇丹紅時，不可避免地也會把樣品中的一些油脂成分提取出來，因此在凈化過程中提前除去樣品中的油脂成分就顯得非常必要?，F(xiàn)行國標GB/T 19681—2005中規(guī)定的方法是使用中性氧化鋁柱來凈化樣品中的油脂，該方法的缺點是操作比較煩瑣，針對基質(zhì)復(fù)雜樣品不能較好地去除樣品中的雜質(zhì)，且中性氧化鋁柱的活度難以控制導(dǎo)致4種蘇丹紅染料的保留差異較大，回收率不穩(wěn)定。因此該試驗針對上述問題進行了研究，將蘇丹紅專用柱和PSD串聯(lián)HLB柱的效果進行比較，結(jié)果顯示，蘇丹紅專用柱不能有效去除油脂帶來的干擾，大部分油脂依然會伴隨蘇丹紅一起洗脫下來，如圖2a所示基質(zhì)干擾峰較多，基質(zhì)干擾強度較大，且與目標化合物保留時間接近，因此不能準確定量。而使用PSD串聯(lián)HLB柱的基質(zhì)干擾現(xiàn)象(圖2b)明顯低于使用蘇丹紅專用柱。這是因為PSD柱和HLB柱填料均可以有效地去除樣品中的油脂成分，并且正己烷淋洗液可以將目標化合物富集至HLB柱中，再用乙酸乙酯對HLB柱進行洗脫，即可有效達到凈化效果，此過程操作更為簡單、溶劑消耗量更少、回收率較穩(wěn)定且能達到國標要求。

注：1.蘇丹紅Ⅰ；2.蘇丹紅Ⅱ；3.蘇丹紅Ⅲ；4.蘇丹紅ⅣNote：1.Sudan dye I；2.Sudan dye Ⅱ；3.Sudan dye Ⅲ；4.Sudan dye Ⅳ圖2 蘇丹紅專用柱(a)和串聯(lián)柱(b)凈化效果色譜圖Fig.2 Chromatogram of purification effect of Sudan dye special column(a)and tandem column(b)

2.5 標準曲線和檢出限以丙酮為溶劑，配制蘇丹紅Ⅰ～ Ⅳ混合標準溶液系列濃度為 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL，進樣10 μL，HPLC分析測定，以峰面積(Y)對濃度 (X，μg /mL)進行回歸分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 回歸方程分別為Y=0.502 8X-0.007 9(蘇丹紅Ⅰ)、Y= 0.582 5X-0.012 1(蘇丹紅Ⅱ)、Y=0.781 6X-0.008 2(蘇丹紅Ⅲ)、Y=0.824 7X-0.017 4(蘇丹紅Ⅳ)，決定系數(shù)(R2)均大于 0.999，表明蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ在0.01～0.20 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該方法適用于辣椒醬中蘇丹紅染料的定量分析。 取陰性辣椒醬樣品，加入逐級稀釋不同濃度的蘇丹紅Ⅰ～ Ⅳ混合標準溶液后進行樣品處理并上機，測得信噪比為 3時對應(yīng)的蘇丹紅的檢出限均為5.0 μg/kg。

2.6 回收率與精密度該試驗選用市場上3種含油量和含水量不同的3種陰性辣椒醬樣品，采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，添加濃度分別為15.0、30.0 和 75.0 μg/kg，對 4種蘇丹紅染料進行了添加回收率試驗，取6次操作的平均值。從表1可以看出，4種蘇丹紅在 3 種不同加標濃度下的回收率為 84%～95%，RSD為1.5%～6.1%。

表1 辣椒醬中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的加標回收率及RSD(n=6)

3 結(jié)論

該研究討論了對于基質(zhì)復(fù)雜的辣椒醬，采用正己烷提取，以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PSD)和N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯(HLB)這2種聚合物基質(zhì)的串聯(lián)固相萃取柱填料進行有效凈化，并結(jié)合高效液相色譜儀測定其中4種蘇丹紅染料的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加濃度分別為15.0、30.0、75.0 μg/kg 時，4種蘇丹紅回收率在84%～95%，RSD在1.5%～6.1%；蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ在0.01～0.20 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.999)，檢出限為5.0 μg/kg。該方法操作簡便、準確度和靈敏度較國標高，適用于辣椒醬中痕量蘇丹紅染料的殘留檢測。