代謝促進劑對赤霉素發(fā)酵的影響及其補料發(fā)酵工藝研究

林 璐，彭 輝，聶志奎

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京 211816；2.江西新瑞豐生化股份有限公司，江西新干 331300)

赤霉素作為植物五大激素之一，是一種天然植物生長調節(jié)劑，對植物生長具有多種生理作用，如調控植物的莖干延長、種子發(fā)芽、打破種子休眠、誘導開花等。目前赤霉素已經(jīng)廣泛應用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和釀造業(yè)等，具有很大的經(jīng)濟效益和市場前景[1-4]。工業(yè)上，赤霉素的合成主要通過藤倉赤霉菌深層液體發(fā)酵獲得。然而，高生產(chǎn)成本嚴重制約著赤霉素的廣泛應用，解決措施除了提高發(fā)酵菌種的性能外，從發(fā)酵過程的精確控制等方面提高其生物合成效率亦是一種有效的方法。

在發(fā)酵過程中，通過外源添加微量的代謝促進劑(表面活性劑、維生素等)能夠顯著提高發(fā)酵過程的產(chǎn)物產(chǎn)量，該方法已被證明具有經(jīng)濟、簡單、高效等優(yōu)勢，廣泛應用于發(fā)酵工業(yè)。表面活性劑是一類加入少量即能使其溶液體系的界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化的物質，據(jù)文獻報道，添加少量的表面活性劑能夠提高發(fā)酵液中的溶氧水平，促進發(fā)酵絲狀真菌的生長和產(chǎn)物合成，而且由于表面活性劑的特殊結構，能夠降低液體表面張力，從而提高細胞膜的通透性，促進細胞胞外代謝物的分泌[5-6]。維生素是一類微生物生長所必需的微量有機物質，能夠調控微生物的物質代謝。例如維生素B6能促進乙酰輔酶A的合成，而乙酰輔酶A是包括赤霉素在內(nèi)的萜類化合物合成前體；維生素B12是以輔酶形式存在，可以增加葉酸的利用率，促進碳水化合物、脂肪和蛋白質的代謝；生物素為羧化酶如丙酮酸羧化酶的輔酶，可以促進胞內(nèi)三羧酸(TCA)循環(huán)。因此維生素的添加也將改變微生物細胞內(nèi)的代謝。該研究針對藤倉赤霉菌的生長和利用其合成赤霉素過程均為需氧過程，且赤霉素為典型的胞外代謝產(chǎn)物這一特征，研究添加不同種類的表面活性劑和維生素對藤倉赤霉菌生長和赤霉素合成的影響，以期進一步提高藤倉赤霉菌合成赤霉素的效率；在此基礎上，針對高濃度初始葡萄糖濃度易產(chǎn)生底物抑制及葡萄糖效應，建立了一種殘?zhí)欠答伒奶賯}赤霉菌發(fā)酵產(chǎn)赤霉素的補料發(fā)酵工藝，以使在實驗室建立的發(fā)酵工藝更加適合于工業(yè)應用。

1 材料與方法

1.1 菌種藤倉赤霉菌(Fusariumfujikuroi)3-6-1，南京工業(yè)大學合成生物制造工程實驗室前期由FusariumfujikuroiCICC 2444經(jīng)過ARTP誘變獲得，該菌主要積累赤霉素GA3。

1.2 培養(yǎng)基PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯塊200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L，pH自然，滅菌條件121 ℃、30 min。種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、酵母膏5.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、KH2PO41.5 g/L、NaMoO4·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液1 mL，pH自然，滅菌條件121 ℃ 30 min。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L、酵母膏5.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、KH2PO41.5 g/L、NaMoO4·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液1 mL，pH自然，滅菌條件121 ℃、30 min。發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、酵母膏5.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、KH2PO41.5 g/L、NaMoO4·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液1 mL，pH自然，滅菌條件121 ℃、30 min。微量元素溶液：H3BO3300 mg/L、MnCl2·4H2O 100 mg/L、ZnSO4·7H2O 100 mg/L、FeCl3·6H2O 200 mg/L、CuCl2·2H2O 500 mg/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1PDA斜面培養(yǎng)。在超凈臺中吸取甘油管中的藤倉赤霉菌液200 μL接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)2～3 d，直至菌絲長滿整個斜面。

1.3.2種子培養(yǎng)。將“1.3.1”培養(yǎng)好的菌種斜面用無菌水沖洗菌絲體，接種于種子培養(yǎng)基，于28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)36 h。

1.3.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。挑取生長良好的種子培養(yǎng)液接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH為4.0，接種量為5%，于28 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)10 d。

1.3.4發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。采用NBS 7.5 L發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，挑取生長良好的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH為4.0，接種量為5%，于28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)10 d。補料發(fā)酵時，添加500 g/L葡萄糖溶液。

1.4 分析方法

1.4.1菌體生物量測定。采用干重法，取一定量的菌液經(jīng)過真空抽濾，并用去離子水洗滌2次，得到的菌絲體經(jīng)過60 ℃恒溫烘干至恒重。

1.4.2葡萄糖含量測定。取一定量的發(fā)酵液，離心后取上清100 μL定容至10 mL，用SBA-40C生物傳感器檢測。

1.4.3赤霉素GA3產(chǎn)量測定。采用高效液相色譜法，方法如下：樣品預處理，將發(fā)酵結束后的發(fā)酵液經(jīng)過12 000 r/min離心5 min取得上清液，上清液通過0.22 μm水系膜過濾后，裝入液相進樣瓶中，進行液相分析。色譜條件：DionexU3000型高效液相色譜儀，Venusil MP C18柱(Ageia Technologies，填料粒徑5 μm)，流動相為甲醇+水+磷酸(體積比為68.00∶32.00∶0.05)，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 表面活性劑對赤霉素合成的影響

2.1.1添加表面活性劑的篩選。選擇十二烷基磺酸鈉(SDS)、甜菜堿、吐溫-80、聚乙二醇、司班-80、硬脂酸6種不同的表面活性劑，在發(fā)酵初始時，均以2%(v/v)的添加量加入發(fā)酵培養(yǎng)基中[7]，結果如表1所示。

表1 添加不同表面活性劑的發(fā)酵結果

分析表1結果可知，添加6種不同表面活性劑的試驗組與對照組相比，生物量無明顯的變化，說明該表面活性劑對藤倉赤霉菌生長沒有毒副作用。其中添加SDS、吐溫-80、硬脂酸均對GA3產(chǎn)量有促進作用，其他添加組GA3產(chǎn)量則有一定量的下降。添加吐溫-80的GA3產(chǎn)量最高，達496.78 mg/L，與對照組相比提高了7.10%。所以下一步將探究吐溫-80的添加量對GA3合成的影響。

2.1.2吐溫-80添加量對赤霉素合成的影響。在發(fā)酵初始時，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加體積比分別為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%的吐溫-80，發(fā)酵結束后，測定生物量與GA3產(chǎn)量，結果如圖1所示。由圖1可知，與對照相比，隨著吐溫-80的濃度增加，生物量與GA3產(chǎn)量均有一定程度的提高。但當吐溫-80的濃度提高至5.0%時，生物量與GA3產(chǎn)量出現(xiàn)大幅下降，說明吐溫-80濃度過高對細胞生長具有毒害作用。當吐溫-80濃度為1.0%時，GA3產(chǎn)量最高，達498.53 mg/L，與對照相比提高了7.87%。因此確定吐溫-80的最佳添加量為1.0%。

圖1 添加不同濃度吐溫-80對赤霉素合成的影響Fig.1 Effect of adding different concentrations of Tween-80 on GA3 synthesis

2.2 維生素對赤霉素合成的影響

2.2.1添加維生素種類的篩選。選擇維生素B1、維生素B6、維生素B12、生物素、維生素C 5種維生素，在發(fā)酵初始時，均以0.2 mg/L的添加量加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，結果如表2所示。由表2可知，添加5種不同維生素的試驗組與對照組相比，生物量均有不同程度的提高，說明維生素能夠促進藤倉赤霉菌的生長。其中添加生物素時生物量最高，達24.16 g/L。另外添加維生素B6、維生素B12、生物素均對GA3產(chǎn)量有促進作用，而維生素B1和維生素C則對GA3合成具有抑制作用，產(chǎn)量均出現(xiàn)降低。下一步擬探究維生素B6、維生素B12、生物素的添加量對GA3合成的影響。

表2 添加不同維生素的發(fā)酵結果

2.2.2維生素B6添加量對赤霉素合成的影響。在發(fā)酵開始時，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加維生素B6，使其終濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 mg/L，對照為不添加任何物質。在發(fā)酵結束后測定生物量與GA3產(chǎn)量，結果如圖2所示。由圖2可知，與對照相比，添加維生素B6時，生物量均有不同程度的提高，說明維生素B6可以促進菌體生長。當維生素B6添加量為0.20 mg/L時，生物量最高，達21.55 g/L，與對照相比提高了20.86%。而隨著維生素B6添加量的增加，GA3產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在維生素B6添加量為0.10 mg/L 時，GA3產(chǎn)量最高，達553.31 mg/L，與對照相比提高了19.40%。由于維生素B6不僅參與生物體內(nèi)的轉氨基反應，還參與輔酶A的合成，所以維生素B6促進GA3合成的原因可能是其促進合成大量GA3前體物質輔酶A，從而提高GA3產(chǎn)量。

圖2 添加不同濃度維生素B6對赤霉素合成的影響Fig.2 Effect of adding different concentrations of vitamin B6 on GA3 synthesis

2.2.3維生素B12添加量對赤霉素合成的影響。發(fā)酵開始時，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加維生素B12，使其終濃度為0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 mg/L，對照為不添加任何物質。在發(fā)酵結束后測定生物量與GA3產(chǎn)量，結果如圖3所示。由圖3可知，與對照相比，添加維生素B12時，生物量的變化不明顯，說明維生素B12對菌體生長影響較小。而維生素B12的添加顯著提高了GA3產(chǎn)量，在維生素B12添加量為0.10 mg/L時，GA3產(chǎn)量最高，達572.17 mg/L，與對照相比提高了24.34%。當維生素B12的添加量超過0.10 mg/L時，GA3產(chǎn)量不再提高反而有下降趨勢，所以0.10 mg/L是維生素B12的最佳添加量。維生素B12促進GA3合成的原因可能是其作為輔酶提高了GA3合成過程中某些關鍵酶的活性，如維生素B12可以提高脫氫酶的活性[7]。

圖3 添加不同濃度維生素B12對赤霉素合成的影響Fig.3 Effect of adding different concentrations of vitamin B12 on GA3 synthesis

2.2.4生物素添加量對赤霉素合成的影響。發(fā)酵開始時，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加生物素，使其終濃度為0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 mg/L，對照為不添加任何物質。在發(fā)酵結束后測定生物量與GA3產(chǎn)量，結果如圖4所示。由圖4可知，與對照相比，添加生物素時，生物量明顯提高，說明生物素有益于菌體生長。當生物素添加量為0.20 mg/L時，生物量最高，達24.65 g/L，與對照相比提高了38.25%。該結論與王寶貝等[8]的研究結果一致。同時生物素的添加也提高了GA3產(chǎn)量，在生物素添加量為0.50 mg/L時，GA3產(chǎn)量最高，達519.37 mg/L，與對照相比提高了12.24%。GA3產(chǎn)量提高主要原因可能是生物素作為細胞內(nèi)多種酶的輔酶，提高細胞整體代謝水平，從而提高了GA3的合成，另外可能是隨著生物量的顯著提高，GA3產(chǎn)量也隨之提高。

圖4 添加不同濃度生物素對赤霉素合成的影響Fig.4 Effect of adding different concentrations of biotin on GA3 synthesis

2.3 殘?zhí)欠答佈a料發(fā)酵工藝的建立葡萄糖作為主要的發(fā)酵碳源，是細胞生長和能量的主要物質來源，同時也是藤倉赤霉菌合成GA3的底物。因此，葡萄糖的濃度和供應速率均會影響細胞的生長代謝和產(chǎn)物合成代謝，所以發(fā)酵過程中葡萄糖的濃度應保持在較低水平[9-10]。葡萄糖補料發(fā)酵工藝可以克服該問題，可以同時利于細胞生長和產(chǎn)物合成。為此，建立了不同初始葡萄糖濃度的殘?zhí)欠答佈a料發(fā)酵工藝，將發(fā)酵液中的葡萄糖濃度控制在10～20、30～40 g/L低濃度水平，考察其對GA3發(fā)酵的影響。

2.3.1初始葡萄糖90 g/L的分批發(fā)酵。在“2.1”和“2.2”的發(fā)酵考察過程中，均是以葡萄糖初始濃度為90 g/L，在7.5 L發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵的，發(fā)酵生長曲線如圖5所示。由圖5可知，在0～24 h時菌體生物量在營養(yǎng)充足的條件快速積累達到15.63 g/L，之后生物量繼續(xù)緩慢上升直至穩(wěn)定期。這說明藤倉赤霉菌適應期極短，對環(huán)境的適應能力較強，高濃度的葡萄糖并沒有抑制藤倉赤霉菌的生長。從葡萄糖消耗曲線來看，葡萄糖前期消耗較快主要用于菌體的生長，后期主要用于維持菌體生長和產(chǎn)物合成。從GA3合成曲線來看，在0～72 h，氮源充足，GA3合成速度較慢；在72～168 h，氮源耗盡，葡萄糖濃度在20～50 g/L，GA3處于快速合成階段；在168～240 h，菌體處于穩(wěn)定期，葡萄糖逐漸耗盡，GA3的合成幾乎停滯。

圖5 藤倉赤霉菌分批發(fā)酵過程Fig.5 Batch fermentation process of Fusarium fujikuroi

2.3.2初糖40 g/L殘?zhí)强刂圃?0～40 g/L的發(fā)酵。在初始葡萄糖濃度為40 g/L的發(fā)酵過程中，當葡萄糖濃度低于30 g/L時，添加葡萄糖以控制葡萄糖的濃度在30～40 g/L，發(fā)酵生長曲線如圖6所示。由圖6可知，生物量的積累曲線與分批發(fā)酵相比幾乎保持一致，說明葡萄糖濃度為30～40 g/L時對菌體的生長影響較小。從GA3合成曲線來看，GA3的積累曲線趨勢與分批發(fā)酵一致，均分為3個不同的階段，但是GA3的合成速率高于分批發(fā)酵，GA3的最終產(chǎn)量為575.13 mg/L，與分批發(fā)酵相比提高了13.86%。從該結果可以說明GA3的合成速率與葡萄糖濃度相關，過高或者過低均不利于GA3的合成。

圖6 初糖40 g/L殘?zhí)强刂圃?0～40 g/L的發(fā)酵過程Fig.6 Fermentation process with initial glucose concentration at 40 g/L with residual glucose controlled at 30-40 g/L

2.3.3初糖30 g/L殘?zhí)强刂圃?0～20 g/L的發(fā)酵。在初始葡萄糖濃度為30 g/L的發(fā)酵過程中，當葡萄糖濃度低于20 g/L時，添加葡萄糖以控制葡萄糖的濃度在10～20 g/L，發(fā)酵生長曲線如圖7所示。由圖7可知，生物量的積累曲線與分批發(fā)酵相比幾乎一致，進一步證實葡萄糖濃度對菌體生長影響較小。從GA3合成曲線來看，GA3的積累曲線趨勢與分批發(fā)酵一致，但是GA3的合成速率低于分批發(fā)酵，GA3的最終產(chǎn)量為394.44 mg/L，與分批發(fā)酵相比降低了21.98%。該結果也進一步可以說明GA3的合成速率與葡萄糖濃度相關，當濃度處于10～20 g/L不利于GA3的合成。原因可能是當葡萄糖濃度較低時，藤倉赤霉菌偏向合成其他副產(chǎn)物，如油脂、比卡菌素等。

圖7 初糖30 g/L殘?zhí)强刂圃?0～20 g/L的發(fā)酵過程Fig.7 Fermentation process with initial glucose concentration at 30 g/L with residual glucose controlled at 10-20 g/L

3 結論

針對藤倉赤霉菌的生長及其合成赤霉素GA3的代謝特征，添加不同的表面活性劑和維生素，考察其對藤倉赤霉菌的生長和赤霉素合成的影響，獲得了最適的表面活性劑和維生素添加種類，發(fā)現(xiàn)吐溫-80、維生素B6、維生素B12、生物素有利于GA3的合成，并對其添加量進行了優(yōu)化。由于優(yōu)化后的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度過高，不利于菌體的快速生長和產(chǎn)物的快速合成，建立了一種殘?zhí)欠答佈a料發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度對菌體生長影響不大，但對GA3的合成影響較大，發(fā)酵過程中控制殘留葡萄糖濃度為30～40 g/L時最有利于GA3的合成。因此，在此操作條件下，控制初糖濃度為40 g/L進行了補料發(fā)酵，最終GA3的發(fā)酵產(chǎn)量達575.13 mg/L，與分批發(fā)酵相比提高了13.86%。