散養(yǎng)和圈養(yǎng)撒壩豬糞菌移植對小鼠生長性能、養(yǎng)分表觀消化率和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

程燕東 胡天念* 殷樺娟 茶光輝 王 璞 楊 凱葉朋飛 潘 瓊 林秋葉** 曹振輝**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201)

哺乳動物腸道內(nèi)定居著細菌、真菌和病毒等眾多微生物，數(shù)量達1014個[1-2]。這些微生物群具有助消化、供給營養(yǎng)、促進腸上皮細胞成熟和抵御病原體的功能[3]，它們與宿主形成共生關(guān)系，共同參與宿主的生長發(fā)育、消化代謝和免疫調(diào)節(jié)[4-5]。在畜禽養(yǎng)殖中，可以通過添加益生元、益生菌或進行糞菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)等方式干預(yù)腸道菌群組成，從而達到調(diào)節(jié)代謝、促進生長發(fā)育、治療疾病和維護機體健康的目的[6]。

FMT是指將健康供體的腸道微生物群移植至受體，以重建腸道菌群，從而達到治療腸道和腸道外疾病、促進受體生長發(fā)育等目的[7]。FMT技術(shù)早期的研究熱點主要集中于疾病治療，并在腸道疾病和其他疾病治療中取得諸多成效。近些年來，許多學(xué)者在畜牧領(lǐng)域逐漸開展了有關(guān)FMT對以豬為代表的動物模型生長、發(fā)育、腸道菌群組成和腸道健康等影響的相關(guān)研究，研究結(jié)果表明，通過FMT引入外源菌群能夠改變受體豬的腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善生長性能[8]，降低腹瀉率[9]，對受體的生長、腸道發(fā)育[10]以及免疫調(diào)節(jié)[11]等產(chǎn)生積極影響。

云南省特殊的地理位置、復(fù)雜的地形地貌、獨特多樣的氣候環(huán)境和多樣的民族農(nóng)耕習(xí)俗孕育了豐富的地方豬資源[12]。撒壩豬作為云南地方豬品種，具有耐粗飼、適應(yīng)性強和抗病力強等優(yōu)點[13]，其消化道中蘊含著豐富的微生物資源，亟待開發(fā)。本試驗以散養(yǎng)和圈養(yǎng)撒壩豬為供體，分別將其糞菌液移植至昆明小鼠，探究其對小鼠生長性能、養(yǎng)分表觀消化率和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以期為FMT技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，同時為飼用益生菌的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選擇云南楚雄當(dāng)?shù)?月齡內(nèi)健康、無病史以及無抗生素服用記錄的純種農(nóng)戶散養(yǎng)撒壩豬和豬場圈養(yǎng)撒壩豬各10頭作為FMT供體，分組采集新鮮糞便，根據(jù)Hu等[14]的方法，取新鮮糞便置于無菌器皿，按照1 g糞便∶5 mL無菌生理鹽水的比例加入無菌生理鹽水，攪拌均勻，依次過2.0、1.0、0.5和0.25 mm的實驗室用篩，濾液在4 ℃條件下、6 000×g離心15 min，棄上清，用無菌生理鹽水重懸沉淀，加入等體積30%甘油置于-80 ℃冰箱低溫保存[15-16]。正式試驗前，將冷凍保存的菌液37 ℃水浴溶解后，4 ℃、6 000×g離心15 min，棄上清，用無菌生理鹽水重懸沉淀得到原菌液，再用1/2原菌液體積的無菌生理鹽水重懸沉淀即得高劑量FMT菌液，高劑量FMT菌液稀釋2倍得到中劑量FMT菌液、稀釋4倍得到低劑量FMT菌液。

選取6周齡體重18～22 g的健康雄性昆明小鼠(購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)30只作為FMT受體，預(yù)飼1周后，隨機分為對照組(CON組)、散養(yǎng)撒壩豬低劑量組(SY-L組)、散養(yǎng)撒壩豬中劑量組(SY-M組)、散養(yǎng)撒壩豬高劑量組(SY-H組)和圈養(yǎng)撒壩豬中劑量組(JY-M組)，每組6只。各組小鼠分別灌胃生理鹽水、散養(yǎng)撒壩豬低劑量FMT菌液、散養(yǎng)撒壩豬中劑量FMT菌液、散養(yǎng)撒壩豬高劑量FMT菌液和圈養(yǎng)撒壩豬中劑量FMT菌液，連續(xù)灌胃14 d，每天1次，每次200 μL。試驗期28 d。

飼養(yǎng)試驗在云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室進行，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在23～26 ℃，相對濕度為50%～70%，晝夜循環(huán)設(shè)定為各12 h。整個飼養(yǎng)階段小鼠自由采食、飲水，飲用水為經(jīng)高溫高壓滅菌處理的自來水，飼糧為無抗顆粒飼料，飼糧組成及營養(yǎng)水平同文獻[17]。

1.2 樣品采集和指標(biāo)測定

1.2.1 生長性能

每周以個體為單位稱量體重，記錄采食量，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.2.2 臟器指數(shù)

FMT試驗結(jié)束后，根據(jù)夏介英等[18]的方法，采用頸椎脫臼法處死小鼠，稱重后，迅速取出心臟、肝臟、脾臟、胃和腎臟稱重，計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(%)=100×[臟器鮮重(g)/活體重(g)]。

1.2.3 養(yǎng)分表觀消化率

參照李月明等[19]的方法，采用全收糞法測定小鼠飼糧養(yǎng)分表觀消化率。試驗最后1周收集每組小鼠糞便樣品，按10 g/mL滴加10%鹽酸固氮，經(jīng)過65 ℃、8～12 h烘干處理為風(fēng)干樣品，然后放置空氣中回潮，用粉碎機粉碎通過40目網(wǎng)篩，于封口袋中置干燥器保存。參照現(xiàn)行國標(biāo)測定水分、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、鈣(Ca)和磷(P)含量，然后計算養(yǎng)分表觀消化率。

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×[(食入飼糧該養(yǎng)分
含量-糞中該養(yǎng)分含量)/食入飼糧該養(yǎng)分含量]。

1.2.4 血脂代謝指標(biāo)

試驗結(jié)束后，使用摘眼球法采集血液，靜置20～30 min后，3 000 r/min、離心10 min，獲得血清樣品，于-80 ℃冷凍保存待用。

用全自動動物血液生化分析儀及試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測定血清甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量。

1.2.5 回腸形態(tài)和杯狀細胞數(shù)

試驗結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剪取試驗小鼠中段回腸組織置于含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，用于蘇木精-伊紅(HE)染色和高碘酸雪夫氏(PAS)染色分析，分別檢測絨毛高度、隱窩深度和杯狀細胞數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，然后用SPSS 25.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較，試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMT對小鼠生長性能的影響

FMT對小鼠生長性能的影響結(jié)果見文獻[17]，結(jié)果顯示，與CON組相比，各FMT組小鼠ADG提高、F/G降低，其中SY-L組和SY-M組差異顯著(P<0.05)；與JY-M組相比，SY-M組小鼠ADG顯著提高(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著降低(P<0.05)。

2.2 FMT對小鼠養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表1可知，與CON組相比，各FMT散養(yǎng)組粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷的表觀消化率均顯著提高(P<0.05)，JY-M組以上指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)；各FMT組粗灰分表觀消化率均顯著提高(P<0.05)；SY-M和SY-H組鈣表觀消化率顯著提高(P<0.05)，其他FMT組鈣表觀消化率差異不顯著(P>0.05)。與JY-M組相比，SY-M組粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、鈣和磷的表觀消化率分別提高了10.32%(P<0.05)、0.56%(P>0.05)、28.39%(P<0.05)、33.32%(P<0.05)和2.50%(P<0.05)。

表1 FMT對小鼠養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 FMT對小鼠臟器指數(shù)的影響

由表2可知，與CON組相比，各FMT組小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，SY-M組與JY-M組上述指標(biāo)之間也均無顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)MT對小鼠內(nèi)臟器官整體無毒副作用。

表2 FMT對小鼠臟器指數(shù)的影響

2.4 FMT對小鼠血脂代謝指標(biāo)的影響

由表3可知，與CON組相比，SY-M組和JY-M組小鼠血清TG含量降低，其中SY-M組差異顯著(P<0.05)；各FMT組小鼠血清TC和HDL-C含量均降低，其中SY-L組、SY-M組和JY-M組差異顯著(P<0.05)；各FMT組小鼠血清LDL-C含量降低，其中SY-M組差異顯著(P<0.05)。SY-M組與JY-M組上述指標(biāo)之間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 FMT對小鼠血脂代謝指標(biāo)的影響

2.5 FMT對小鼠回腸形態(tài)和杯狀細胞數(shù)的影響

由表4、圖1和圖2可知，與CON組相比，各FMT組小鼠回腸絨毛高度無顯著變化(P>0.05)；各FMT組小鼠回腸隱窩深度降低，其中JY-M組差異顯著(P<0.05)；各FMT組絨毛高度/隱窩深度值提高，其中SY-M組差異顯著(P<0.05)；SY-L組、SY-M組、SY-H組和JY-M組小鼠回腸杯狀細胞數(shù)分別增加了1.79%、28.51%、27.47%和15.02%(P>0.05)。與JY-M組相比，SY-M組小鼠回腸絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P>0.05)，絨毛高度/隱窩深度值有升高趨勢(P>0.05)，回腸杯狀細胞數(shù)增加了11.72%(P>0.05)。

表4 FMT對小鼠回腸形態(tài)和杯狀細胞數(shù)的影響

圖1 小鼠回腸絨毛高度和隱窩深度HE染色圖

圖2 小鼠回腸杯狀細胞PAS染色圖

3 討 論

3.1 FMT對小鼠生長性能的影響

腸道微生物是影響動物體生長發(fā)育的重要因素之一，哺乳動物腸道微生物能夠促進動物對養(yǎng)分的消化吸收及代謝，將動物腸道中不能被消化吸收的碳水化合物等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能被動物機體消化吸收的物質(zhì)，進而促進動物生長[20]。大量研究證實，由FMT介導(dǎo)的外源性微生物群的植入能夠提高動物ADG，促進動物生長。Hu等[8]將健康成年金華豬的糞菌液移植至“杜長大”新生仔豬，結(jié)果顯示仔豬的ADG顯著提高。張卓[21]將健康成年“杜長大”公豬糞菌液移植至新生長榮二雜仔豬，結(jié)果表明，F(xiàn)MT組仔豬的ADG比對照組提高了36.1%。黃金華等[22]研究表明，在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加7%的母體糞菌液，能夠顯著提高其ADG，降低F/G。本試驗將散養(yǎng)和圈養(yǎng)撒壩豬糞菌液移植至小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各FMT組小鼠的ADG提高、F/G降低，且SY-M組ADG最高、F/G最低，這與黃金華等[23]的研究結(jié)果相似，表明不同劑量以及不同來源的糞菌液移植均能提高小鼠的生長性能，且在本試驗條件下，SY-M組的效果最佳。在本試驗中，SY-M組的ADG顯著高于JY-M組，F(xiàn)/G顯著低于JY-M組，這可能是因為散養(yǎng)撒壩豬所處環(huán)境和采食的復(fù)雜性，其腸道菌群多樣性較高，將其糞菌液移植給小鼠后，小鼠腸道菌群多樣性增加，對養(yǎng)分的作用機制增強，從而更能促進機體生長。

3.2 FMT對小鼠養(yǎng)分表觀消化率的影響

養(yǎng)分表觀消化率是衡量動物消化能力的重要指標(biāo)。腸道內(nèi)的益生菌能夠促進飼糧在動物體內(nèi)的消化吸收，提高養(yǎng)分表觀消化率。Hou等[24]研究表明，在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑能夠顯著提高仔豬對粗蛋白質(zhì)的表觀消化率。宋獻藝等[25]在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%的復(fù)合益生菌制劑，結(jié)果表明，益生菌組仔豬粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高。王志成等[26]研究表明，在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合益生菌制劑能夠顯著提高仔豬粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率。由此可知，腸道微生態(tài)環(huán)境的改變可直接影響動物對養(yǎng)分的表觀消化率。本試驗結(jié)果顯示，各FMT散養(yǎng)組粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率均顯著提高，表明FMT可通過增加小鼠腸道菌群多樣性和有益菌數(shù)量，提高小鼠對養(yǎng)分的消化，從而促進小鼠生長。

3.3 FMT對小鼠血脂代謝的影響

血清TG、TC、LDL-C和HDL-C含量是反映機體脂代謝水平的重要指標(biāo)。TG和TC含量在一定程度上可以反映機體的脂肪代謝水平，TG是體脂的主要成分，血液中TG含量升高會導(dǎo)致機體的脂肪沉積[27]；TC是機體脂類代謝的重要指標(biāo)，它參與機體的代謝和物質(zhì)的合成，其含量升高會引起心血管病等疾病[28]。

FMT能夠重塑腸道菌群結(jié)構(gòu)，直接或間接影響機體代謝[29]。郭上齊等[30]用高脂高能飼糧誘導(dǎo)產(chǎn)生肥胖大鼠模型，將常規(guī)飲食大鼠糞菌液移植至模型鼠，結(jié)果表明FMT可顯著降低模型鼠血清TG和TC含量。李月芹[31]將正常大鼠糞菌液移植至高脂飼糧模型大鼠，結(jié)果表明，F(xiàn)MT組大鼠血清TG含量顯著低于模型組。Zhang等[32]將哈薩克族人的糞菌液移植至db/db小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血清TG、TC和LDL-C含量顯著降低。本試驗將散養(yǎng)和圈養(yǎng)撒壩豬糞菌液移植至小鼠后，各FMT組小鼠粗脂肪表觀消化率提高，血清TC、LDL-C和HDL-C含量降低，且SY-M組差異顯著。此外，本團隊前期研究結(jié)果表明，與CON組相比，各FMT組小鼠總脂肪指數(shù)均顯著降低[17]，而總脂肪指數(shù)是反映機體脂肪總量的指標(biāo)，一定程度上可以反映機體脂肪沉積能力。以上結(jié)果表明，散養(yǎng)和圈養(yǎng)撒壩豬糞菌液移植均能增強小鼠的脂肪代謝能力，減少脂肪沉積，且綜合各指標(biāo)可知SY-M組小鼠脂代謝能力最強。有研究指出，脂肪沉積與腸道微生物組成的改變高度相關(guān)，肥胖個體腸道中厚壁菌門豐度增加，厚壁菌門/擬桿菌門值升高[33]。本試驗前期研究結(jié)果表明，門水平上物種豐度結(jié)果顯示，與CON組相比，各FMT組小鼠腸道中厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門/擬桿菌門值降低[17]。這與Ley等[34]的研究結(jié)果一致，表明FMT能夠通過改變腸道微生物的組成，減少脂肪沉積。

以上研究結(jié)果表明，F(xiàn)MT可通過改善腸道微生物組成、降低厚壁菌門豐度、提高擬桿菌門豐度、降低厚壁菌門/擬桿菌門值以及提高粗脂肪表觀消化率增強小鼠脂代謝能力，從而減少脂肪沉積，降低總脂肪指數(shù)，降低血清中TC、LDL-C和HDL-C含量。

3.4 FMT對小鼠回腸形態(tài)和杯狀細胞數(shù)的影響

小腸是動物養(yǎng)分消化吸收的主要部位，小腸絨毛高度和隱窩深度是衡量小腸消化吸收能力的重要指標(biāo)[35]。腸絨毛長短決定其含有成熟絨毛細胞的數(shù)量，從而反映其對養(yǎng)分的吸收能力；隱窩深度主要反映腸上皮細胞的生成率，上皮細胞不斷從隱窩基部向絨毛端部遷移、分化，形成具有吸收能力的絨毛細胞，從而補充絨毛細胞的正常脫落。隱窩變淺，表明細胞成熟率上升，分泌功能增強[36]；絨毛高度/隱窩深度值綜合反映小腸消化吸收功能，其值減小表明黏膜受損、消化吸收功能下降[37]。杯狀細胞源于腸道隱窩基底部的多能干細胞[38]，廣泛分布于消化道的上皮細胞中，小腸杯狀細胞是由其前身低黏液細胞分化而來[39]，能夠合成黏蛋白防止腸道過度炎性反應(yīng)，對維持黏膜穩(wěn)態(tài)起重要作用[40]。

張卓等[10]將成年豬糞菌液移植至新生長榮二雜仔豬，結(jié)果表明，F(xiàn)MT能夠極顯著降低十二指腸絨毛高度。岳曉敬[41]將金華豬糞菌液灌喂“杜長大”三元雜交新生仔豬，結(jié)果表明，F(xiàn)MT可提高小腸絨毛高度/隱窩深度值，增加回腸和結(jié)腸杯狀細胞數(shù)，改善腸道黏膜形態(tài)，促進腸黏膜發(fā)育。以上研究表明FMT可以促進腸道發(fā)育。本試驗中，各FMT組小鼠回腸隱窩深度降低，絨毛高度/隱窩深度值升高，杯狀細胞數(shù)增加，與耿世杰等[42]的研究結(jié)果相似，表明散養(yǎng)和圈養(yǎng)撒壩豬糞菌液移植能夠降低腸道隱窩深度，提高絨毛高度/隱窩深度值，增加杯狀細胞數(shù)，從而改善小鼠腸黏膜發(fā)育、維持腸黏膜屏障并增強腸道的消化能力。

4 結(jié) 論

散養(yǎng)和圈養(yǎng)撒壩豬糞菌液移植可促進小鼠腸道黏膜發(fā)育，提高養(yǎng)分表觀消化率，增強脂代謝能力，降低F/G，從而提高生長性能；其中，散養(yǎng)撒壩豬中劑量糞菌液移植效果較優(yōu)。