琥珀酸對肉質(zhì)性狀及免疫反應(yīng)影響的研究進展

張 寧 茍 妍 張力莉 徐曉鋒

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750021)

琥珀酸，又名丁二酸，是所有需氧生物中三羧酸循環(huán)(TCA)的代謝中間體。琥珀酸也是腸道中微生物丙酸合成的關(guān)鍵中間體，是腸道中重要的微生物代謝物[1]。研究表明，腸道菌群也會產(chǎn)生一定數(shù)量的琥珀酸[2]。在腸腔中，琥珀酸積累的程度比單鏈脂肪酸小，單鏈脂肪酸的濃度通常在1～3 mmol/L(或mmol/kg)，但根據(jù)物種和樣本類型的不同而不同[3]。之前研究認(rèn)為，微生物產(chǎn)生的琥珀酸會繼續(xù)被轉(zhuǎn)化為丙酸，積累濃度會很少[4]，但飼喂添加琥珀酸飼糧，小鼠盲腸琥珀酸濃度顯著升高[5]。

1 琥珀酸對肉質(zhì)性狀的影響

肌纖維類型與肌內(nèi)脂肪是影響肉質(zhì)性狀的重要因素。肌纖維類型影響肉的嫩度、肌內(nèi)脂肪含量和系水力[6]。肌內(nèi)脂肪的含量與組成很大程度上決定肉的色澤、嫩度、多汁性和風(fēng)味[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物代謝產(chǎn)生的琥珀酸在單胃動物肌纖維轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要信號作用[9]。

琥珀酸可通過細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體91(G-protein-coupled receptor 91，GPR91)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度升高[10]。胞內(nèi)Ca2+在肌肉的生長發(fā)育、類型轉(zhuǎn)化上起重要作用，是骨骼肌中活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)和促進肌管分化和蛋白合成的重要第二信使[11-12]。Ca2+信號變化對肌肉前體細(xì)胞成肌成脂分化過程具有重要調(diào)控作用[9]。在小鼠上研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸對調(diào)控鼠骨骼肌肌纖維類型具有重要調(diào)節(jié)作用，進而改變肌肉的嫩度[6]。Wang等[13]研究表明，在肌纖維類型轉(zhuǎn)化過程中，琥珀酸經(jīng)過細(xì)胞膜受體GPR91誘導(dǎo)激活磷脂酶-Cβ(phospholipase-Cβ，PLC-β)，進而產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate，IP3)和二?；视?diacylglycerol，DG)2個第二信使，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度增加，進而激活Ca2+/NFAT(細(xì)胞核因子)通路，調(diào)控肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MyHC)的基因表達(dá)從而影響肌纖維類型。

研究表明，琥珀酸通過作用于糖異生途徑促進腸道葡萄糖異生，提高肝糖原生成[14-16]。在動物機體組織中，琥珀酸通過三羧酸循環(huán)變成草酰乙酸，然后在磷酸烯醇式丙酮酸、果糖-1，6-二磷酸酶等作用下異生為葡萄糖，琥珀酸通過糖異生途徑，增加肌肉細(xì)胞的葡萄糖含量。目前在小鼠和豬的琥珀酸營養(yǎng)研究報道中，添加1%琥珀酸顯著降低豬肉滴水損失并且可以通過促進骨骼肌的蛋白合成促進肌肉生長[10]；2 mmol/L琥珀酸處理的小鼠C2C12細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅱa型肌球蛋白重鏈蛋白表達(dá)提高并指出琥珀酸可通過其重要受體GPR91調(diào)控小鼠骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)變[6]。在魚上的研究表明，0.15%琥珀酸添加量促使其肌肉脂肪合成相關(guān)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)基因表達(dá)分別上調(diào)89.7%和2.2倍[17]。但關(guān)于琥珀酸對反芻動物體組織肌內(nèi)脂肪沉積的研究鮮見報道。

2 琥珀酸對免疫反應(yīng)的影響

近年來，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中琥珀酸可以活化炎癥因子的表達(dá)，并促進炎癥反應(yīng)，另外琥珀酸不僅是呼吸鏈代謝的基質(zhì)，同時也是炎癥、低氧、代謝等信號傳遞中的“信號分子”，并且可能作為生物標(biāo)志物在炎癥和代謝紊亂中發(fā)揮作用[18]。一些研究已經(jīng)證明琥珀酸在調(diào)節(jié)腸道炎癥和免疫中起著至關(guān)重要的作用[19-21]。琥珀酸可在炎性組織中聚集，其作用機制是通過介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)腸道炎癥和纖維化[20]。

2.1 炎癥中琥珀酸的信號調(diào)節(jié)機制

琥珀酸可激活巨噬細(xì)胞中的缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)，并通過琥珀酸受體1(succinate receptor 1，SUCNR1)刺激樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)[22]。琥珀酸通過介導(dǎo)炎癥信號的傳遞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[23]。

2.1.1 琥珀酸和HIF-1α

琥珀酸在低氧條件下積聚在細(xì)胞內(nèi)，是對缺氧的代謝特征反應(yīng)[3]。在缺氧反應(yīng)中，HIF-1α作為關(guān)鍵傳感器起著調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)的作用，以適應(yīng)缺氧的條件。在常氧條件下，HIF-1α通過蛋白翻譯后的羥基化或者靶向蛋白質(zhì)經(jīng)過脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase domain，PHD)作用后降解2種途徑來調(diào)節(jié)[23]。PHD是依賴氧的，因此氧氣濃度降低會阻止HIF-1α的羥基化，并且增強了HIF-1α依賴性基因的表達(dá)，使得磷酸戊糖途徑激活和ATP快速生成，導(dǎo)致HIF-1α的穩(wěn)定和活化，這些變化也增加了細(xì)胞的生物合成能力[24]。此外，由于PHD脫羥基反應(yīng)將氧氣和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸和二氧化碳，高水平的琥珀酸可以通過抑制其產(chǎn)物來減緩PHD降解[25]。已有文獻(xiàn)報道，琥珀酸能直接抑制巨噬細(xì)胞中PHD活性，穩(wěn)定HIF-1α[26]。巨噬細(xì)胞被革蘭氏陰性菌分泌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活后，能夠增加琥珀酸的含量[27]。通過LPS的刺激，巨噬細(xì)胞中三羧酸循環(huán)被破壞后，谷氨酰胺合成酶導(dǎo)致向M2極化的巨噬細(xì)胞偏向M1表型，其特征是細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺減少和琥珀酸增加[28]，另外琥珀酸還可以γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)分流途徑產(chǎn)生，GABA滲透酶將GABA分流與三羧酸循環(huán)連接起來，導(dǎo)致琥珀酸的積累[29]。LPS刺激下這2種回補途徑均被加強，使琥珀酸增多從而穩(wěn)定HIF-1α，其下游靶基因表達(dá)量也增多以及蛋白的琥珀?；黾覽30]。HIF-1α在腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中被認(rèn)為是通過提高上皮屏障的作用，降低上皮細(xì)胞的凋亡，從而減輕腸道的炎癥[31]。因此，免疫疾病的固有免疫反應(yīng)引發(fā)的炎癥，可以通過作為炎癥信號的琥珀酸得到更好的認(rèn)識。

細(xì)胞內(nèi)琥珀酸通過氧化途徑增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成和蓄積[32]，ROS產(chǎn)生和相關(guān)代謝途徑的改變可以導(dǎo)致促炎巨噬細(xì)胞比靜息巨噬細(xì)胞更具糖酵解性，從而產(chǎn)生更多的ROS并且積累更多的琥珀酸[33]。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)是一種參與琥珀酸代謝相關(guān)途徑的酶，其突變亦可影響炎癥過程[27]。研究表明，通過藥理學(xué)(可將琥珀酸轉(zhuǎn)化為富馬酸的酶)或者經(jīng)SDHB的RNA干擾抑制SDH的遠(yuǎn)端亞基，增加常氧中ROS的產(chǎn)生，以ROS依賴性方式來穩(wěn)定HIF-1α，并在體外和體內(nèi)增加生長速率，而不影響缺氧介導(dǎo)的HIF-1α活化[34]。另外，HIF-1α活性受PHD輔助因子鐵離子(Fe2+)的影響，由于Fe2+對氧分子親和力低，會使HIF-1α穩(wěn)定并活化，但ROS可將Fe2+氧化成Fe3+，導(dǎo)致HIF-1α的穩(wěn)定化受到影響[35]。因此，琥珀酸可以通過直接抑制PHD或誘導(dǎo)ROS 2種途徑來穩(wěn)定HIF-1α。

2.1.2 琥珀酸和SUCNR1信號

GPR91，也叫SUCNR1，琥珀酸通過作用于細(xì)胞膜上SUCNR1從而引起一系列炎癥反應(yīng)[36]。琥珀酸通過其同源受體SUCNR1感測，以細(xì)胞和組織依賴性方式激活各種信號通路，具有多種功能效應(yīng)[37]。SUCNR1在各種細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞、DC、小腸和大腸、腎臟、肝臟和脂肪組織[38-39]。琥珀酸與細(xì)胞中的SUCNRl結(jié)合后，由SUCNR1觸發(fā)的信號包括Gα蛋白亞基(Gα protein subunit)Gαi和Gαq介導(dǎo)的通路，Gαi介導(dǎo)的通路通過腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)導(dǎo)致環(huán)狀磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)抑制，Gαq導(dǎo)致蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)磷酸化和鈣的動員[40]。另外，琥珀酸刺激SUCNR1也會導(dǎo)致一氧化氮和前列腺素(E2)的產(chǎn)生[22]，其通過分泌E2和清除細(xì)胞外琥珀酸來緩解炎癥[41]。

早期研究表明，琥珀酸與Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)協(xié)同作用并與SUCNR1聯(lián)合能促進骨髓細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[3]。SUCNR1結(jié)合琥珀酸后，可以增強腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和促炎細(xì)胞因子中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β的表達(dá)和釋放[42]。琥珀酸也能在細(xì)胞外聚集并通過自分泌和旁分泌方式活化SUCNR1，從而促進IL-1β的生成并加重炎癥[43]。TLR在非特異性免疫中起著關(guān)鍵作用，琥珀酸與TLR3或TLR7的不同信號通路中具有協(xié)同效應(yīng)，可以通過ERK1/2磷酸化促進細(xì)胞因子的生成[44]，TLR能識別外來的物質(zhì)，并能刺激機體產(chǎn)生對免疫細(xì)胞的應(yīng)答。

SUCNR1是介導(dǎo)琥珀酸刺激活性所需的唯一受體，并且SUCNR1必須在DC上表達(dá)來發(fā)揮這些免疫調(diào)節(jié)作用。經(jīng)過琥珀酸處理后，DC能在遷移到淋巴結(jié)的過程中，整合抗原和琥珀酸介導(dǎo)的信號，成為有效的抗原呈遞細(xì)胞[45]。另外，琥珀酸直接誘導(dǎo)DC的趨化性，并與TLR配體協(xié)同作用，誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生和表達(dá)增加[45]?；罨腄C分泌各種細(xì)胞因子和炎性趨化因子，并上調(diào)參與T細(xì)胞活化的刺激受體[46]。琥珀酸還可以增強T細(xì)胞的抗原驅(qū)動反應(yīng)，這些效應(yīng)依賴于DC上的SUCNR1表達(dá)，因為琥珀酸對DC的T細(xì)胞增殖、TNF-α和干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)的生成具有一定的劑量依賴性[45]。這些研究證實了在細(xì)胞增強抗原遞呈功能中琥珀酸的信號傳導(dǎo)是必需的。

2.2 琥珀酸對腸道炎癥細(xì)胞因子的影響

腸上皮完整性與免疫反應(yīng)有關(guān)。先前的研究表明，琥珀酸不僅通過激活DC和巨噬細(xì)胞來增強Ⅰ型免疫力，而且還通過刺激腸道簇狀細(xì)胞來啟動Ⅱ型免疫反應(yīng)[21]。調(diào)節(jié)腸道炎癥作用中包括琥珀酸對體內(nèi)和體外腸道炎癥細(xì)胞因子的影響。

2.2.1 體內(nèi)試驗炎癥細(xì)胞因子的影響

豬飼糧添加1%琥珀酸后空腸中的mRNA表達(dá)和IL-25及其IL-10蛋白濃度更高[47]。IL-25主要由小鼠腸道黏膜CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生[48]。此外，小腸中的IL-25也由簇狀細(xì)胞產(chǎn)生，并激活Ⅱ型先天淋巴細(xì)胞(ILC2s)以分泌IL-13，從而引發(fā)Ⅱ型免疫反應(yīng)，包括杯狀和簇狀細(xì)胞增生[49]。研究表明，飼糧中添加琥珀酸能明顯促進IL-25的表達(dá)，并能誘發(fā)空腸Ⅱ型免疫[20]。IL-10作為抗炎細(xì)胞因子，可以促進Ⅱ型反應(yīng)組織修復(fù)，主要是由腸道免疫細(xì)胞大量產(chǎn)生，包括DC、巨噬細(xì)胞、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞[50]。不同的是，在目前的研究中盡管琥珀酸已被證明可以增強骨髓源性巨噬細(xì)胞炎癥期間IL-1β的產(chǎn)生，但補充琥珀酸并不影響豬空腸中的IL-1β表達(dá)[23]。1%的琥珀酸可以通過IL-8的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)分泌的上調(diào)來引起炎癥反應(yīng)，腸上皮細(xì)胞分泌的IL-8在中性粒細(xì)胞募集中具有重要作用[51]。同樣，丁酸也被證明可以在豬小腸上皮細(xì)胞(intestinal porcine epithelial cells，IPEC-J2)中誘導(dǎo)IL-8分泌[52]。研究也指出，飼糧添加1%琥珀酸鈉可增加空腸中IL-25、IL-10、IL-8和IL-18的mRNA表達(dá)水平[47]，抗炎和促炎細(xì)胞因子水平升高，說明琥珀酸具有促進腸道免疫功能的作用。琥珀酸對炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)說明其可以通過激活免疫反應(yīng)來增強腸道免疫功能。

2.2.2 體外試驗炎癥細(xì)胞因子的影響

在體外，琥珀酸處理不影響IL-10的表達(dá)，但對IL-18、IL-8和IL-6的表達(dá)有一定促進作用。Th(T helper)細(xì)胞是一種輔助性細(xì)胞，IL-6作為炎性細(xì)胞因子參與Th17細(xì)胞的發(fā)育[53]。研究表明，IL-6在上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中能促進腸道上皮細(xì)胞的增生，并能促進黏膜的修復(fù)[54]。IL-18在用200和300 mmol/L醋酸處理的無特異性病原體(specific-pathogen-free，SPF)小鼠中增加，有助于維持腸上皮完整性，修復(fù)和腸道穩(wěn)態(tài)[55]。腸道中琥珀酸是丙酸的前體物質(zhì)。研究表明，丙酸上調(diào)了腸道中IL-18的表達(dá)[56]。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)在小腸形態(tài)和功能方面發(fā)揮重要作用[57]，尤其是丁酸鹽，通過增加IPEC-J2和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(colorectal adenocarcinoma cells，Caco-2)的跨膜電阻值(trans-epithelial electrical resistance,TEER)來促進上皮完整性[58]，丁酸可以在這2種細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-8的分泌[52]。體外試驗中，5 mmol/L琥珀酸可通過IPEC-J2細(xì)胞中的TEER來降低其通透性，在體內(nèi)1%琥珀酸促進了閉鎖小帶蛋白(ZO)-1和ZO-2的表達(dá)[47]。緊密連接蛋白對調(diào)節(jié)腸上皮通透性具有關(guān)鍵作用，嚴(yán)重的炎癥可以使Caco-2細(xì)胞中ZO-2表達(dá)下調(diào)從而導(dǎo)致上皮功能受損[59]。而TEER增加可歸因于ZO-1和ZO-2的上調(diào)[47]。琥珀酸對緊密連接蛋白的上調(diào)和對炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)增加表明琥珀酸促進了腸道上皮細(xì)胞的緊密完整性。另外研究指出，腸道免疫可以通過琥珀酸同源受體GPR91來調(diào)節(jié)[19]，相關(guān)研究亦證明飼糧添加琥珀酸后GPR91的mRNA水平和蛋白濃度在豬空腸顯著增加[47]，這可能也是導(dǎo)致體內(nèi)外試驗結(jié)果不同的原因之一。

3 小 結(jié)

肉品質(zhì)是動物生產(chǎn)中的重要組成部分，肌纖維類型和肌內(nèi)脂肪含量在改善肉質(zhì)性狀中起關(guān)鍵作用。因此，了解肌纖維對肉質(zhì)的影響及琥珀酸對肌纖維的影響和機制，可以為動物肉質(zhì)調(diào)控提供相關(guān)理論依據(jù)，具有實際意義，但琥珀酸對肌內(nèi)脂肪的影響仍需進一步研究。近年來，琥珀酸在免疫代謝和炎癥反應(yīng)中的作用也愈加重要，至于體外試驗的結(jié)果不能完全與體內(nèi)試驗結(jié)果一致，研究目前尚待深入，才能獲得肯定的結(jié)論。琥珀酸作為一個新研究領(lǐng)域，在開發(fā)上仍然存在許多限制，不能全面了解這些代謝物在動物體內(nèi)的作用，是否能廣泛運用于動物生產(chǎn)有待進一步探討。