高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便發(fā)酵參數(shù)和菌群多樣性的影響

李 斌 王 夢(mèng) 韓印如 孫寶麗 郭勇慶 劉德武

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州510642)

近年來，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，規(guī)模化水平和產(chǎn)奶量逐年提高。但是，優(yōu)質(zhì)粗飼料短缺的現(xiàn)狀，使得生產(chǎn)中不得不飼喂含有大量谷物或脂肪的高能飼糧，以滿足高產(chǎn)奶牛的能量需求。飼糧的精粗比影響反芻動(dòng)物胃腸道健康和生產(chǎn)性能，當(dāng)精料比例過低時(shí)，產(chǎn)生的丙酸不足，葡萄糖異生受限，機(jī)體會(huì)動(dòng)用大量的體脂提供能量，誘發(fā)酮病和妊娠毒血癥[1]；當(dāng)精料比例過高時(shí)，則會(huì)引起瘤胃pH過低或波動(dòng)增加，造成胃腸道發(fā)酵參數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)改變，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis,SARA)和乳脂合成抑制(milk fat depression,MFD)[2-3]。同時(shí)，高精料飼糧可損傷反芻動(dòng)物后腸道的腸道屏障和黏膜上皮，造成上皮細(xì)胞凋亡增加，緊密連接蛋白表達(dá)異常,誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)[4-5]。

飼糧中添加適量脂肪可以改善奶牛的能量供給，提高泌乳性能和繁殖性能[6-8]。研究顯示，在飼糧中添加1.5%或3.0%的大豆油可以促進(jìn)奶牛胰島素和胰島素樣生長因子Ⅰ的分泌，抑制胰高血糖素和瘦素的分泌，從而起到提高葡萄糖利用效率和產(chǎn)奶量的作用[9]。飼糧中油脂的種類和含量也可影響動(dòng)物的胃腸道菌群組成，如飼喂含棕櫚油的飼糧可使小鼠結(jié)腸中疣微菌門的相對(duì)豐度顯著上升[10]。當(dāng)飼糧中油脂含量過高時(shí)，尤其是含有大量不飽和脂肪酸時(shí)，會(huì)在飼料顆粒和微生物細(xì)胞表面形成疏水涂層，從而破壞微生物細(xì)胞膜，抑制反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的降解[11-12]。研究表明，飼糧中補(bǔ)充玉米油會(huì)降低綿羊瘤胃中酸性洗滌纖維(ADF)和脂肪酸的消化率[13]。

目前，關(guān)于飼糧淀粉或油脂含量對(duì)奶牛影響的相關(guān)研究主要集中在瘤胃方面，對(duì)于后腸道發(fā)酵和菌群多樣性變化的研究相對(duì)較少。此外，以往試驗(yàn)飼糧大多只添加淀粉或油脂，二者共同添加如何影響后腸道發(fā)酵和菌群變化目前尚不明確。因此，本試驗(yàn)通過給奶牛飼喂高淀粉高油脂飼糧，研究其對(duì)奶牛后腸道發(fā)酵參數(shù)和菌群多樣性的影響，為科學(xué)配制飼糧和提高奶牛的生產(chǎn)性能提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選取來自廣東省某奶牛場(chǎng)的8頭荷斯坦奶牛[泌乳天數(shù)：(215±34) d，體重：(575±23) kg]作為試驗(yàn)動(dòng)物。采用全混合日糧(TMR)飼喂，日飼喂2次(07:00和17:00)，保證5%～10%的剩料量；每天的06:30和16:30分2次機(jī)器擠奶。奶牛拴系飼養(yǎng)，自由飲水，躺臥區(qū)鋪有橡膠墊和細(xì)沙，日清糞2次。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正式試驗(yàn)開始前進(jìn)行10 d的預(yù)飼，在此期間所用奶牛均飼喂基礎(chǔ)飼糧。正試期采用2×2反轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將8頭奶牛隨機(jī)分為2組，每組4頭，進(jìn)行2期的飼喂試驗(yàn)，每期23 d，第2期對(duì)照組和試驗(yàn)組對(duì)調(diào)。每期的前16 d，對(duì)照組奶牛飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組奶牛飼喂高淀粉高油脂飼糧[在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加266 g/kg DM粉碎玉米(過1.2～1.5 mm篩)和46 g/kg DM大豆油]；后7 d為恢復(fù)期，2組奶牛均飼喂基礎(chǔ)飼糧。試驗(yàn)組奶牛在每期試驗(yàn)的前4 d進(jìn)行飼糧過渡。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items基礎(chǔ)飼糧 Basal diet 高淀粉高油脂飼糧 High starch-high oil diet過瘤胃脂肪 Rumen bypass fat0.780.59預(yù)混料 Premix1)0.460.35磷酸氫鈣 CaHPO40.360.27石粉 CaCO30.720.55小蘇打 NaHCO30.720.55氧化鎂 MgO0.130.10食鹽 NaCl0.360.27合計(jì) Total100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)有機(jī)物 OM92.9494.31泌乳凈能 NEL/(MJ/kg)6.787.66粗蛋白質(zhì) CP16.1014.12中性洗滌纖維 NDF31.4326.42酸性洗滌纖維ADF19.4515.78淀粉 Starch23.7731.43粗脂肪 EE4.557.80

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 飼糧樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)期每天記錄每頭牛的采食量和剩料量，計(jì)算干物質(zhì)采食量(DMI)，并于每期的第13～15天采集TMR和飼料原料，65 ℃烘干后粉碎，參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》中的方法測(cè)定干物質(zhì)(DM)、有機(jī)物(OM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量，采用比色法測(cè)定淀粉含量[14]。

1.3.2 糞便樣品采集和發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

試驗(yàn)期第13～15天記錄每頭牛的糞便評(píng)分，糞便評(píng)分參考Lawrence等[15]的1～5分評(píng)分方法。采用直腸取樣法，分別于每個(gè)試驗(yàn)期的第15天晨飼后0、4、8和12 h采集新鮮糞便樣品(300～500 g)，將采集的糞便樣品分別進(jìn)行如下處理：1)將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的糞便取10 g加入20 mL的重蒸水，充分渦旋后測(cè)定pH(PB-10 pH計(jì)，Sartorius，德國)，將稀釋后的糞便以10 845×g離心15 min分離上清液，上清液按照5∶1的比例加入25%偏磷酸，用于氨態(tài)氮(NH3-N)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度的測(cè)定，NH3-N濃度參考馮宗慈等[16]的方法測(cè)定，VFA濃度參照Cao等[17]的方法采用氣相色譜儀(Agilent 7890B，美國)測(cè)定，并計(jì)算總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度；2)取晨飼后4 h采集的糞便樣品分裝至2 mL凍存管，-80 ℃冰箱保存，用于DNA提取和高通量測(cè)序分析。

1.3.3 糞便菌群多樣性檢測(cè)

對(duì)采集的糞便樣品進(jìn)行16S rRNA基因V3～V4區(qū)域高通量測(cè)序，分析菌群多樣性。DNA提取采用TIANGEN DNA Stool Mini Kit，具體抽提程序參照其說明書。提取的DNA通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。PCR擴(kuò)增采用的上游引物序列為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，下游引物序列為5’-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3’。PCR反應(yīng)步驟為98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸30 s，最后于72 ℃延長5 min。通過對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行過濾、雙端拼接，得到；將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類，劃分操作分類單元(OTU)，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類。使用Qiime 2軟件生成不同分類水平上的物種相對(duì)豐度表，用R軟件繪制成樣品各分類水平上的群落結(jié)構(gòu)圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行初步處理，采用SAS 9.4中的MIXED程序進(jìn)行處理計(jì)算。奶牛的DMI、糞便評(píng)分、菌群相對(duì)豐度及其代謝通路采用以下分析模型：

Yijk=μ+Oh+Ti+Nj(Oh)+Pk+εijk。

式中：Yijk=試驗(yàn)牛在不同處理下的因變量值；μ=總體均值；Oh=次序效應(yīng)(h=1,2)；Ti=飼糧i的處理效應(yīng)(i=1，2)；Nj=嵌套次序的試驗(yàn)牛j的隨機(jī)效應(yīng)(j=1,2,3,…,8)；Pk=時(shí)期效應(yīng)(k=1,2)；εijk=隨機(jī)誤差效應(yīng)。

糞便發(fā)酵參數(shù)采用以下分析模型：

Yijk=μ+Oh+Ti+Nj(Oh)+Pk+Xl+Ti×Xl+εijk。

式中：Yijk=試驗(yàn)牛在不同處理下的因變量值；μ=總體均值；Oh=次序效應(yīng)(h=1，2)；Ti=飼糧i的處理效應(yīng)(i=1，2)；Nj=嵌套次序的試驗(yàn)牛j的隨機(jī)效應(yīng)(j=1,2,3,…,8)；Pk=時(shí)期效應(yīng)(k=1，2)；Xl=采樣時(shí)間點(diǎn)(l=0，4，8，12)；εijk=隨機(jī)誤差。

利用Tukey法進(jìn)行組間差異比較，以P<0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛DMI和糞便評(píng)分的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組奶牛的DMI和糞便評(píng)分顯著降低(P<0.05)。

表2 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛DMI和糞便評(píng)分的影響

2.2 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，飼喂高淀粉高油脂飼糧后，奶牛糞便的pH、丙酸濃度、乙酸摩爾比顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，NH3-N濃度有降低趨勢(shì)(P=0.07)，而丁酸摩爾比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便發(fā)酵參數(shù)的影響

由圖1可知，1 d內(nèi)，隨著晨飼后時(shí)間的延長，2組奶牛糞便pH均呈逐漸上升趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；NH3-N濃度呈先升高后降低趨勢(shì)，其中晨飼后4 h時(shí)試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組乙酸濃度呈逐漸下降趨勢(shì)，試驗(yàn)組則呈先升高后降低趨勢(shì)，其中晨飼后0 h時(shí)試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；2組的丙酸濃度均呈逐漸下降趨勢(shì)，其中晨飼后0和4 h時(shí)試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組丁酸濃度受晨飼后時(shí)間的影響較小，對(duì)照組則呈逐漸下降趨勢(shì)，其中晨飼后12 h時(shí)試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組TVFA濃度呈逐漸下降趨勢(shì)，試驗(yàn)組則呈先升高后降低趨勢(shì)，但TVFA濃度未受飼糧處理的顯著影響(P>0.05)。

數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注*表示試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

2.3 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便菌群多樣性和組成的影響

2.3.1 糞便菌群的Venn圖

如圖2所示，在97%的相似水平上，2組共得到了8 312個(gè)OTU，2組間共有3 928個(gè)OTU，其中對(duì)照組和試驗(yàn)組獨(dú)有的OTU數(shù)目分別為2 049和2 345個(gè)。

2.3.2 糞便菌群的α多樣性分析

由表4可知，試驗(yàn)組的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)及Shannon指數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，說明飼喂高淀粉高油脂飼糧后糞便菌群的豐富度和多樣性顯著降低。

2.3.3 糞便菌群的β多樣性分析

由圖3可知，主成分1(PC1)的貢獻(xiàn)值為60.93%，主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)值為15.5%，對(duì)照組和試驗(yàn)組明顯區(qū)分開，對(duì)照組奶牛糞便樣點(diǎn)基本集中分布，試驗(yàn)組奶牛糞便樣點(diǎn)相對(duì)分散。

2.3.4 糞便菌群物種豐度分析

本試驗(yàn)在奶牛的糞便中共鑒定出14個(gè)門，24個(gè)綱，37個(gè)目，63個(gè)科，119個(gè)屬的細(xì)菌。相對(duì)豐度排名前10的菌門如表4所示，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)這3個(gè)菌門均是2組糞便菌群中的優(yōu)勢(shì)菌門。由表5可知，當(dāng)飼喂高淀粉高油脂飼糧后，奶牛糞便中放線菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和TM7的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)。厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋菌門(Spirochae-tes)和軟壁菌門(Tenericutes)的相對(duì)豐度未受飼糧處理的顯著影響(P>0.05)。

圖2 奶牛糞便菌群Venn圖

表4 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便菌群α多樣性指數(shù)的影響

圖3 奶牛糞便菌群主坐標(biāo)分析圖

由表6可知，在屬水平上，2組奶牛糞便菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬均為瘤胃球菌科未分類屬(unclassified_Ruminococcaceae)和擬桿菌目未分類屬(unclassified_Bacteroidales)。與對(duì)照組相比，高淀粉高油脂飼糧顯著降低了糞便中瘤胃球菌科未分類屬、擬桿菌目未分類屬和梭菌目未分類屬(unclassified_Clostridiales)的相對(duì)豐度(P<0.05)，顯著提高了毛螺旋菌科未分類屬(unclassified_Lachnospiraceae)和琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)的相對(duì)豐度(P<0.05)。奶牛糞便中CF231、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、S24-7菌科未分類屬(unclassified_S24-7)和羅氏菌屬(Roseburia)的相對(duì)豐度未受飼糧處理的顯著影響(P>0.05)。

表5 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便菌群門水平相對(duì)豐度的影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items對(duì)照組Control group試驗(yàn)組Test groupSEMP值P-value疣微菌門 Verrucomicrobia0.230.010.21<0.01TM70.330.030.070.01其他 Others0.080.230.060.10

表6 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便菌群屬水平相對(duì)豐度的影響

2.3.5 糞便菌群屬水平相對(duì)豐度與糞便發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)分析

圖4展示了奶牛糞便菌群屬水平相對(duì)豐度(排名前20的菌屬)與糞便發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性。NH3-N濃度與瘤胃球菌科未分類屬(P=0.030)、理研菌科未分類屬(unclassified_Rikenellaceae)(P=0.049)和RF16菌群未分類屬(unclassified_RF16)(P=0.012)的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與羅氏菌屬(P=0.047)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；乙酸濃度與CF231(P=0.032)、S24-7菌科未分類屬(P=0.033)、多爾氏菌屬(Dorea)(P=0.026)和密螺旋體屬(Treponema)(P=0.014)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；丙酸濃度與S24-7菌科未分類屬(P=0.007)、5-7N15(P=0.023)和多爾氏菌屬(P=0.032)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；丁酸濃度與毛螺旋菌科未分類屬(P=0.007)、羅氏菌屬(P=0.050)、琥珀酸弧菌屬(P<0.001)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)(P=0.016)和布勞特氏屬(Blautia)(P<0.001)的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與瘤胃球菌科未分類屬(P<0.001)、擬桿菌目未分類屬(P=0.007)、CF231(P=0.025)、多爾氏菌屬(P=0.040)、理研菌科未分類屬(P=0.039)和密螺旋體屬(P=0.038)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；乙酸/丙酸與CF231(P=0.012)、S24-7菌科未分類屬(P=0.016)、5-7N15(P=0.022)、多爾氏菌屬(P=0.009)和密螺旋體屬(P=0.007)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.3.6 糞便菌群功能預(yù)測(cè)分析

2組奶牛糞便菌群在KEGG二級(jí)代謝通路上排名前10的功能見圖5?？傮w上看，2組奶牛糞便菌群代謝功能相近，膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、翻譯等功能的相對(duì)豐度較高。由表7可知，試驗(yàn)組糞便菌群的氨基酸代謝功能的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

Unclassified_Ruminococcaceae：瘤胃球菌科未分類屬；Unclassified_Bacteroidales：擬桿菌目未分類屬；Unclassified_Clostridiales：梭菌目未分類屬；Unclassified_Lachnospiraceae：毛螺旋菌科未分類屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Unclassified_S24-7：S24-7菌科未分類屬；Roseburia：羅氏菌屬；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Prevotella：普雷沃氏菌屬；Clostridium1：梭菌屬1；Unclassified_Peptostreptococcaceae：消化鏈球菌科未分類屬；Dorea：多爾氏菌屬；Unclassified_Rikenellaceae：理研菌科未分類屬；Unclassified_Clostridiaceae：梭菌科未分類屬；Treponema：密螺旋體屬；Blautia：布勞特氏屬；Unclassified _RF16：RF16菌群未分類屬；Unclassified_RF39：RF39目未分類屬；NH3-N：氨態(tài)氮；Acetate：乙酸；Propionate：丙酸；Butyrate：丁酸；Acetate/propionate：乙酸/丙酸；TVFA：總揮發(fā)性脂肪酸 total volatile fatty acids。

3 討 論

3.1 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛DMI和糞便評(píng)分的影響

DMI易受到飼糧能量水平和精粗比等多種因素的影響[18]。當(dāng)飼糧中能量水平達(dá)到高限時(shí)，大量的碳水化合物在瘤胃迅速發(fā)酵，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，破壞了瘤胃內(nèi)的發(fā)酵環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)消化，進(jìn)一步抑制采食量[1]。糞便評(píng)分可以反映奶牛營養(yǎng)物質(zhì)消化狀況，其中2分表明可能出現(xiàn)了飼糧蛋白質(zhì)或淀粉水平過高、酸中毒、飼料腐敗變質(zhì)等問題，3分為理想分?jǐn)?shù)，說明飼糧平衡，過瘤胃速度適宜。本研究中試驗(yàn)組奶牛糞便評(píng)分較低，這主要是由于試驗(yàn)組奶牛飼糧的精料比例高于對(duì)照組，瘤胃中未降解的淀粉可進(jìn)入小腸和大腸，引起腸道上皮結(jié)構(gòu)和后腸道發(fā)酵參數(shù)發(fā)生變化，進(jìn)一步造成腹瀉和損害機(jī)體健康。

3.2 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便發(fā)酵參數(shù)的影響

淀粉在反芻動(dòng)物全腸道的消化位點(diǎn)主要是瘤胃、小腸和后腸道。在瘤胃和小腸未被水解的淀粉會(huì)被后腸道微生物利用生成乙酸、丙酸和丁酸等VFA[19]。VFA是反芻動(dòng)物能量利用過程中重要的中間產(chǎn)物，可經(jīng)過腸壁吸收，參與代謝[20]，其濃度和組成主要受飼糧組成的影響[21]。晨飼后試驗(yàn)組奶牛糞便中TVFA濃度呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)樵囼?yàn)組奶牛的后腸道可發(fā)酵碳水化合物含量較高，產(chǎn)生了大量的VFA，而大量的VFA會(huì)導(dǎo)致奶牛后腸道的酸度降低，所以試驗(yàn)組奶牛糞便的pH顯著降低。Neubauer等[22]研究表明，在奶牛飼糧中添加淀粉會(huì)降低糞便的pH，長時(shí)間飼喂高精料比例的飼糧，會(huì)使奶牛瘤胃中大量未完全消化的食糜流入腸道，導(dǎo)致后腸道發(fā)酵活動(dòng)加強(qiáng)。Mao等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，奶牛飼喂高谷物飼糧后，糞便中丁酸和TVFA濃度顯著升高，pH顯著降低，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。M?ller等[24]研究發(fā)現(xiàn)，三葉草青貯和高脂肪濃縮飼料配制的飼糧可以增加奶牛糞便中TVFA的濃度，表明飼糧中脂肪含量也會(huì)影響后腸道的發(fā)酵。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組奶牛糞便中乙酸濃度較對(duì)照組有所降低，與Neubauer等[22]的研究結(jié)果相似，在其研究中用高精料飼糧飼喂奶牛后，糞便中乙酸和丙酸濃度均出現(xiàn)下降。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧飼喂奶牛后瘤胃中乙酸濃度顯著降低；Toral等[26]在奶牛和山羊飼糧中添加魚油(FO組)或同時(shí)添加葵花籽油和淀粉(SOS組)后發(fā)現(xiàn)，瘤胃中乙酸濃度顯著下降。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組飼糧和Toral等[26]的試驗(yàn)中SOS組飼糧均為低NDF和高淀粉飼糧，會(huì)對(duì)纖維素分解細(xì)菌的數(shù)量產(chǎn)生潛在的負(fù)面影響，導(dǎo)致乙酸濃度降低[27]，也有研究表明后腸道黏膜會(huì)優(yōu)先代謝乙酸作為主要能量來源[4,22]，因此使得乙酸濃度有所降低。

Metabolism: Nucleotide Metabolism：新陳代謝：核苷酸代謝；Unclassified: Cellular Processes and Signaling：未分類：細(xì)胞過程和信號(hào)；Metabolism: Metabolism of Cofactors and Vitamins：新陳代謝：輔助因子和維生素代謝；Unclassified: Poorly Characterized：未分類：特征不明顯；Metabolism: Energy Metabolism：新陳代謝；能量代謝；Genetic Information Processing: Translation：遺傳信息處理：翻譯；Genetic Information Processing: Replication and Repair：遺傳信息處理：復(fù)制和修復(fù)；Metabolism: Amino Acid Metabolism：新陳代謝：氨基酸代謝；Metabolism: Carbohydrate Metabolism：新陳代謝：碳水化合物代謝；Environmental Information Processing: Membrane Transport：環(huán)境信息處理：膜運(yùn)輸。

表7 高淀粉高油脂飼糧對(duì)糞便菌群KEGG二級(jí)代謝通路的影響

續(xù)表7項(xiàng)目Items對(duì)照組Control group試驗(yàn)組Test groupSEMP值P-value輔助因子和維生素代謝 Metabolism of cofactors and vitamins4.30 4.35 0.03 0.63細(xì)胞過程和信號(hào) Cellular processes and signaling3.89 4.02 0.03 0.42核苷酸代謝 Nucleotide metabolism4.11 4.00 0.04 0.42

飼糧碳水化合物含量可影響腸道微生物多樣性、群落功能和代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、膽汁酸、維生素等，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫水平[28]。晨飼后，試驗(yàn)組和對(duì)照組糞便的pH和各VFA濃度呈一定的變化規(guī)律，表明飼糧處理會(huì)影響后腸道中可發(fā)酵碳水化合物的發(fā)酵速度及規(guī)律，可能是由2組飼糧經(jīng)過瘤胃和小腸到達(dá)后腸道中可發(fā)酵的碳水化合物數(shù)量不同引起的，因此微生物發(fā)酵產(chǎn)物的數(shù)量也存在不一致。后腸道的內(nèi)環(huán)境會(huì)隨著可發(fā)酵底物和采食時(shí)間出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，因此晨飼后糞便pH和各VFA濃度也相應(yīng)出現(xiàn)波動(dòng)。

3.3 高淀粉高油脂飼糧對(duì)奶牛糞便菌群多樣性和組成的影響

ACE指數(shù)和Chao指數(shù)可反映微生物的豐度，Simpion指數(shù)和Shannon指數(shù)可反映微生物的多樣性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，高淀粉高油脂飼糧顯著降低了糞便菌群的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)，表明高淀粉高油脂飼糧會(huì)使奶牛糞便菌群的豐富度和多樣性顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，Neubauer等[22]在飼糧中添加27.7%的淀粉后，奶牛糞便菌群豐富度和多樣性會(huì)降低；Tao等[30]的研究也表明，短期或長期飼喂高精料飼糧后，山羊后腸道菌群豐富度和多樣性均顯著降低。因而，飼糧中精料比例過高使反芻動(dòng)物后腸道出現(xiàn)失調(diào)，可對(duì)微生態(tài)環(huán)境的生物多樣性產(chǎn)生不利影響。

碳水化合物是反芻動(dòng)物的主要能量來源，同時(shí)也是腸道微生物的發(fā)酵底物，因此是影響腸道微生物組成的重要因素[31-32]。本研究中，2組奶牛糞便菌群在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌均為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，與其他反芻動(dòng)物后腸道和糞便微生物的研究結(jié)果[33-34]一致。試驗(yàn)組奶牛后腸道微生態(tài)環(huán)境受飼糧處理的顯著影響，但其優(yōu)勢(shì)菌門中種類沒有發(fā)生改變，表明哺乳動(dòng)物腸道中優(yōu)勢(shì)菌群在門水平上受飼糧因素影響較小。放線菌門是天然抗生素的來源，其代謝物具有抗病毒、抗腫瘤和抗菌等活性，可以起到保護(hù)宿主的作用[35]；疣微菌門具有調(diào)節(jié)性免疫的潛力，腸道微生物可能通過干預(yù)它來達(dá)到調(diào)節(jié)免疫[36]。試驗(yàn)組奶牛糞便中疣微菌門和放線菌門的相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著下降，表明高淀粉高油脂飼糧可能會(huì)降低有益菌的繁殖，影響后腸道的健康和免疫調(diào)節(jié)。

在屬水平上，2組奶牛糞便中未分類的菌屬中優(yōu)勢(shì)菌屬為瘤胃菌科未分類屬、擬桿菌目未分類屬、梭菌目未分類屬和毛螺旋菌科未分類屬。瘤胃球菌科屬于厚壁菌門，可以分解纖維和淀粉而產(chǎn)生乙酸、甲酸和琥珀酸等[37]。Russell等[38]研究表明，瘤胃球菌科對(duì)酸度較敏感，在低pH下不會(huì)消化纖維，瘤胃球菌科未分類屬相對(duì)豐度顯著降低；Neubaue等[22]研究表明，高精料飼糧導(dǎo)致奶牛糞便中瘤胃球菌科相對(duì)豐度降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。擬桿菌目屬于擬桿菌門，為革蘭氏陰性菌，在植物結(jié)構(gòu)多糖的分解和發(fā)酵中發(fā)揮重要作用。本研究中，試驗(yàn)組擬桿菌目未分類屬的相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著降低，表明高淀粉高油脂飼糧會(huì)影響后腸道中植物多糖的分解和發(fā)酵。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高谷物飼喂山羊后其盲腸腔內(nèi)pH和擬桿菌屬相對(duì)豐度降低，與本研究結(jié)果相似。毛螺菌科屬于厚壁菌門，為牛、羊胃腸道和糞便中的常見菌，可以水解淀粉和其他糖以產(chǎn)生丁酸及其他短鏈脂肪酸，當(dāng)飼糧中精料比例突然增加時(shí)，菌群具有旺盛的代謝潛力。琥珀酸弧菌屬可發(fā)酵多種糖，其代謝最終產(chǎn)物為乙酸、琥珀酸及少量的甲酸和乳酸。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組奶牛糞便中毛螺菌科未分類屬和琥珀酸弧菌屬的相對(duì)豐度均較對(duì)照組顯著增加。Mao等[23]研究也表明，飼喂高精料飼糧可導(dǎo)致奶牛糞便中毛螺菌科和琥珀酸弧菌屬的相對(duì)豐度增加。雙歧桿菌屬可以消化腸道的復(fù)雜多糖或低聚糖，具有抗炎作用[39]。本研究中，試驗(yàn)組奶牛糞便中雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度與對(duì)照組相比呈下降趨勢(shì)，說明發(fā)生炎癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。

3.4 奶牛糞便菌群屬水平相對(duì)豐度和糞便發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性及功能預(yù)測(cè)分析

采用高精料飼糧飼喂時(shí)，奶牛后腸道細(xì)菌會(huì)利用淀粉等營養(yǎng)素，引起密螺旋體屬多糖降解菌數(shù)量的增加[40]。本研究從相關(guān)性分析表明，密螺旋體屬的相對(duì)豐度與乙酸濃度和乙酸/丙酸呈顯著負(fù)相關(guān)，說明了密螺旋體屬參與碳水化合物降解和VFA代謝。羅氏菌屬屬于厚壁菌門，可以分解不可消化的碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸，主要產(chǎn)物為丁酸，作為一種高產(chǎn)丁酸菌，可能對(duì)控制腸道炎癥過程具有重要作用[41]，與本研究中試驗(yàn)組奶牛糞便中丁酸摩爾比顯著增加的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。利用糞便菌群挖掘一些與重要營養(yǎng)生理功能密切相關(guān)的后腸道菌群功能是非常必要的。本試驗(yàn)中，2組奶牛糞便菌群的代謝功能相近，高淀粉高油脂飼糧降低了糞便菌群氨基酸代謝功能的相對(duì)豐度，且試驗(yàn)組糞便的NH3-N濃度顯著降低，表明高淀粉高油脂飼糧影響了奶牛胃腸道的微生態(tài)環(huán)境。

4 結(jié) 論

高淀粉高油脂飼糧可降低奶牛的DMI和糞便評(píng)分，影響后腸道的發(fā)酵參數(shù)，降低糞便菌群的豐富度和多樣性，存在降低奶牛腸道免疫性能和誘發(fā)炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，生產(chǎn)中采用高精料飼糧飼喂奶牛時(shí)，不僅要關(guān)注瘤胃健康，同時(shí)也要關(guān)注糞便狀態(tài)、后腸道發(fā)酵參數(shù)及后腸道健康。