飼糧添加茶多酚對馬崗鵝空腸組織形態(tài)、抗氧化能力及緊密連接蛋白相關(guān)基因表達的影響

王育川 林 桐 陳艾玲 馬婷婷 鐘雅靜王寶東 劉春朋 付 晶*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣州510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院，廣州510225；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；4.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，沈陽110032)

腸道既是鵝進行養(yǎng)分消化吸收、物質(zhì)新陳代謝的主要器官，又是保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的先天性屏障[1]，保持腸道健康是實現(xiàn)鵝高效養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。然而，在鵝生產(chǎn)周期中高飼料轉(zhuǎn)化率，養(yǎng)殖環(huán)境應(yīng)激(如溫度、水體、病原菌入侵)和頻繁的免疫程序等，均可導(dǎo)致鵝在機體代謝過程中產(chǎn)生大量的自由基，造成鵝生長性能下降、腸道組織負(fù)荷過重等不良后果[2]。尤其是飼料禁抗以來，鵝腸道健康問題日益突出。腸道因其特有的血管解剖結(jié)構(gòu)特點以及對流氧交換機制決定了其在應(yīng)激狀態(tài)下更容易發(fā)生氧化損傷，表現(xiàn)為腸道結(jié)構(gòu)受損、消化吸收功能下降以及通透性增加等[3-4]。因此，尋找安全、高效的功能性飼料添加劑來提高鵝腸道抗氧化能力顯得尤為重要。

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，主要成分包括黃烷醇類(兒茶素)、黃酮醇類、酚酸類、黃酮類和花色苷類等物質(zhì)，其中兒茶素占茶多酚總量的65%～80%[5]。茶多酚因結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，具有較強的抗氧化能力；除此之外還具有提高免疫力、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和腸道健康等功效[6]。隨著動物營養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，茶多酚作為一種新型綠色飼料添加劑已應(yīng)用于家禽生產(chǎn)。劉梅等[7]研究表明，茶多酚可以顯著提高愛拔益加(AA)肉仔雞血清抗氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性并顯著降低丙二醛(MDA)含量，進而促進肉雞機體的抗氧化能力。Wang等[8]研究表明，在1日齡AA肉雞飼糧中添加兒茶素可通過提高肉雞的胸腺指數(shù)、增加血清免疫球蛋白Y(IgY)和免疫球蛋白A(IgA)含量和上調(diào)肉雞法氏囊中IgY和IgA基因相對表達量，提高肉雞的抗氧化能力和免疫能力。鐘雅靜等[9]研究表明，種鴿飼糧添加茶多酚能夠改善乳鴿肌肉嫩度和抗氧化能力。付晶等[10]研究表明，飼糧添加適宜劑量茶多酚可以提高乳鴿十二指腸抗氧化能力及物理屏障功能。目前，關(guān)于茶多酚在養(yǎng)鵝生產(chǎn)中的應(yīng)用尤其是對鵝腸道健康的調(diào)控作用鮮有報道。本課題組前期研究結(jié)果表明，飼糧添加茶多酚對馬崗鵝的生長性能無顯著影響，此外1 000 mg/kg的茶多酚可以降低腹脂沉積并提高肌肉的抗氧化能力，進而改善馬崗鵝的屠宰性能和肌肉品質(zhì)[11]。鑒于此，本試驗通過在馬崗鵝基礎(chǔ)飼糧中添加不同劑量的茶多酚，觀察其對70日齡馬崗鵝空腸形態(tài)發(fā)育、抗氧化能力以及緊密連接蛋白相關(guān)基因表達的影響，進一步探討茶多酚對腸道健康的影響，以期為茶多酚在養(yǎng)鵝生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用茶多酚購自成都某生物有限公司，其純度為98.7%。

28日齡馬崗鵝由廣東省清遠(yuǎn)市金羽豐鵝業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用單因素完全隨機分組設(shè)計，選取28日齡體況良好、體重基本一致的馬崗鵝240只(公母各占1/2)，隨機分成4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)10只鵝。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，低、中、高劑量茶多酚組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加100、500和1 000 mg/kg茶多酚。試驗期共6周，其中預(yù)試期1周，正試期5周。

1.3 試驗飼糧

本試驗采用玉米-豆粕-麩皮型基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧配方參考NRC(1994)鵝的營養(yǎng)需要量并結(jié)合廣東省馬崗鵝的生產(chǎn)經(jīng)驗配制。其營養(yǎng)水平為：代謝能12.16 MJ/kg、粗蛋白質(zhì)15.00%、水分14.00%、粗灰分7.00%、粗纖維4.80%、鈣1.20%、磷0.59%、總賴氨酸0.85%(以上均為計算值)。具體基礎(chǔ)飼糧組成見本課題組已發(fā)表文獻[11]。

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在廣東省清遠(yuǎn)市金羽豐鵝業(yè)有限公司開展。鵝舍包括地面運動場和水池，水池的水每4 d更換1次。試驗前用生石灰對鵝舍進行消毒，試驗期間按照常規(guī)防疫程序進行消毒和防疫。舍內(nèi)設(shè)有水槽和料槽，試驗鵝在試驗期間均自由采食和飲水。每天觀察鵝群健康狀況和計算耗料量，每2周對鵝進行稱重，每次稱重前1晚斷料12 h。

1.5 樣品采集與處理

70日齡時，每組隨機選取6只公鵝，空腹12 h后進行剖殺，采集空腸組織。一部分直接固定于福爾馬林溶液中，用于空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察；另一部分輕輕刮取空腸黏膜組織，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于測定抗氧化能力以及與腸壁通透性相關(guān)基因的mRNA相對表達量。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

采集固定在福爾馬林溶液中的空腸組織塊經(jīng)水洗，石蠟切片制作(脫水、透明、包埋、修塊、切片)和蘇木精-伊紅(HE)染色等過程制成空腸黏膜組織切片。在光鏡下進行觀察、拍照記錄，并利用軟件Image-Pro Plus 6.0測量空腸的絨毛高度、隱窩深度，計算絨隱比。

1.6.2 空腸組織抗氧化能力

稱取0.1 g左右空腸組織置于冰上，按照1∶9的比例加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，使用組織破碎儀將其充分破碎后，置于4 ℃離心機中，按3 000 r/min離心20 min，取上清液備用。

采用南京建成生物工程研究所相應(yīng)試劑盒測定空腸GSH-Px、T-SOD、乳酸脫氫酶(LDH)活性及MDA含量；采用泉州科諾迪生物技術(shù)有限公司相應(yīng)試劑盒測定空腸谷胱甘肽過氧化物酶2(GPX2)活性。

1.6.3 空腸黏膜抗氧化及腸道通透性相關(guān)基因表達

參考文獻[12]，采用Trizol法提取空腸黏膜組織中總RNA，并進行濃度及純度的測定。選擇提取質(zhì)量較高的RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄說明書所示步驟反轉(zhuǎn)成cDNA，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank中檢索的相關(guān)基因序列，利用Oligo Primer Analysis軟件(6.0)設(shè)計引物，并交付上海生工生物工程股份有限公司進行引物合成，引物序列如表1所示。采用SYBR Green熒光染料法，按照PowerUpTMSYBR Green Master Mix試劑盒使用說明書進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)試驗，每個樣品平行做3個重復(fù)，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，進行檢測基因mRNA表達量的相對定量分析，并利用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表1 引物序列

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時用Tukey法進行多重比較，并對飼糧中不同添加量茶多酚的效應(yīng)進行線性和二次回歸分析，以期獲得適宜的添加劑量。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對馬崗鵝空腸黏膜形態(tài)的影響

由圖1和表2可知，與對照組相比，500 mg/kg組的絨毛高度顯著提高(P<0.05)，且隨著茶多酚添加量增加呈二次曲線變化(P<0.05)；100和500 mg/kg組的隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，并隨著茶多酚添加量增加呈二次曲線變化(P<0.05)。

通過對絨毛高度、隱窩深度、絨隱比(Y)分別與飼糧茶多酚的添加量(X)進行二次曲線擬合，建立回歸方程：Y(絨毛高度)=250.775+759.303X-6 698.402X2(R2=0.448，PQ=0.002)，Y(隱窩深度)=45.982-379.021X+3 435.522X2(R2=0.272，PQ=0.036),Y(絨隱比)=5.640+73.905X-681.574X2(R2=0.351，PQ=0.011)。根據(jù)曲線回歸方程可以得出茶多酚添加量為567 mg/kg時絨毛高度最高，添加量為552 mg/kg時隱窩深度最低，添加量為542 mg/kg時絨隱比最高。以上結(jié)果表明，飼糧茶多酚添加量為542～567 mg/kg時，可以促進馬崗鵝空腸絨毛增長，降低隱窩深度，并提高絨隱比，進而提高空腸消化吸收能力。

A: 70日齡對照組(40×);B：70日齡100 mg/kg組(40×); C：70日齡500 mg/kg組(40×); D：70日齡1 000 mg/kg組(40×); 圖1中箭頭的長度代表空腸絨毛的高度。

2.2 茶多酚對馬崗鵝空腸組織抗氧化能力的影響

由表3可知，與對照組相比，500和1 000 mg/kg組空腸GSH-Px、T-SOD和GPX2活性均顯著提高(P<0.05)，其中GSH-Px和GPX2活性呈線性變化且具有劑量依賴性(P<0.05)，T-SOD活性則呈線性和二次曲線變化(P<0.05)；100和500 mg/kg組空腸MDA含量顯著降低(P<0.05)，呈二次曲線變化(P<0.05)；3個茶多酚組空腸LDH活性顯著降低(P<0.05)，呈線性和二次曲線變化(P<0.05)。

通過對空腸T-SOD、MDA、LDH活性(Y)分別與飼糧茶多酚的添加量(X)進行二次曲線擬合，建立回歸方程：Y(T-SOD)=133.174+1 078.959X-7 464.548X2(R2=0.489，PQ=0.001)，Y(MDA)=0.489-7.019X+62.699X2(R2=0.344，PQ=0.012)，Y(LDH)=4.555-48.363X+442.624X2(R2=0.530，PQ<0.001)。根據(jù)曲線回歸方程可以得出茶多酚添加量為722 mg/kg時空腸T-SOD活性最高，添加量為560 mg/kg時空腸MDA含量最低，添加量為546 mg/kg時空腸LDH活性最低。以上研究結(jié)果表明，飼糧添加546～722 mg/kg茶多酚時能夠提高馬崗鵝空腸抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，有效提高馬崗鵝空腸組織抗氧化能力。

2.3 茶多酚對馬崗鵝空腸組織與抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

由表4可知，與對照組相比，500和1 000 mg/kg組馬崗鵝空腸組織的超氧化物歧化酶1(SOD1)、谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)、GPX2和血紅素氧合酶-1(HO-1)mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，且呈線性和二次曲線變化(P<0.05)。

通過對空腸SOD1、GPX1、GPX2、HO-1 mRNA相對表達量(Y)分別與飼糧茶多酚的添加量(X)進行二次曲線擬合，建立回歸方程：Y(SOD1)=0.934+33.8X-223.722X2(R2=0.946，PQ<0.001)，Y(GPX1)=0.957+13.064X-97.867X2(R2=0.580，PQ<0.001)，Y(GPX2)=0.984+8.716X-63.71X2(R2=0.597，PQ<0.001)，Y(HO-1)=0.939+29.505X-213.775X2(R2=0.900，PQ<0.001)。根據(jù)曲線回歸方程可以得出茶多酚添加量為755 mg/kg時空腸SOD1 mRNA相對表達量最高，添加量為667 mg/kg時空腸GPX1 mRNA相對表達量最高，添加量為684 mg/kg時空腸GPX2 mRNA相對表達量最高，添加量為690 mg/kg時空腸HO-1 mRNA相對表達量最高。以上研究結(jié)果表明，飼糧添加667～755 mg/kg茶多酚時能提高馬崗鵝空腸組織中與抗氧化相關(guān)基因的mRNA相對表達量，該結(jié)果也進一步從分子水平證明茶多酚能夠增強空腸組織的抗氧化能力。

表2 飼糧添加茶多酚對馬崗鵝空腸黏膜形態(tài)發(fā)育的影響

表3 飼糧添加茶多酚對馬崗鵝空腸組織抗氧化能力的影響

表4 飼糧添加茶多酚對馬崗鵝空腸組織與抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

2.4 茶多酚對馬崗鵝空腸組織緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

由表5可知，與對照組相比，500和1 000 mg/kg組馬崗鵝空腸的緊密連接蛋白相關(guān)基因閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉合蛋白-5(Claudin-5)和咬合蛋白(Occludin)的mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，其中ZO-1 mRNA相對表達量呈線性和二次曲線變化(P<0.05)，而Claudin-5和OccludinmRNA相對表達量呈線性變化且具有劑量依賴性(P<0.05)；3個茶多酚組的空腸E鈣黏連蛋白(E-cadherin)mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，呈線性變化且具有劑量依賴性(P<0.05)。

通過對ZO-1 mRNA相對表達量(Y)與飼糧茶多酚的添加量(X)進行二次曲線擬合，建立回歸方程：Y(ZO-1)=0.974+13.619X-67.253X2(R2=0.808，PQ<0.001)。以上研究結(jié)果表明，飼糧添加1 013 mg/kg茶多酚時可以提高馬崗鵝空腸中ZO-1 mRNA相對表達量，提高腸道緊密連接的程度。

表5 飼糧添加茶多酚對馬崗鵝空腸組織緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 茶多酚對馬崗鵝空腸組織抗氧化能力的影響

MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量間接反映了機體氧化損傷的程度[19]。LDH是糖酵解過程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞質(zhì)氧化還原酶，LDH正常情況下存在于機體組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷時，細(xì)胞膜受損，LDH容易從胞質(zhì)內(nèi)泄漏，因此，LDH活性升高是機體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志之一[20]。李忠浩等[21]發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼糧中添加100、150、200 mg/kg的茶多酚，可有效地降低MDA含量。曾亮[22]研究報道，添加兒茶素能降低鴨腿肉和鴨胸肉中MDA含量，從而增加鴨肉的保鮮時間。本研究與前人的研究結(jié)果基本一致，即茶多酚可以不同程度地提高馬崗鵝空腸組織抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，進而提高其抗氧化能力。這可能與多酚類化合物本身特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)酚羥基有關(guān)。羥基是氫的供體，可提供活潑氫、滅活自由基，進而抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生[23]。

鑒于此，本研究進一步從分子水平探究茶多酚對馬崗鵝空腸黏膜組織抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響。HO-1是血紅素降解的限速酶，周蓉等[24]建立體外醋酸鉛誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)HO-1可通過上調(diào)自噬減輕醋酸鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以通過促進空腸SOD1、GPX1、GPX2和HO-1等抗氧化酶相關(guān)基因的mRNA相對表達，增強馬崗鵝空腸的抗氧化能力，這與本研究結(jié)果中，茶多酚可以顯著提高馬崗鵝空腸抗氧化酶活性、抑制過氧化反應(yīng)結(jié)果相符。

3.2 茶多酚對馬崗鵝空腸形態(tài)發(fā)育及緊密連接程度的影響

空腸是鵝營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場所，腸絨毛高度、隱窩深度以及絨隱比是評價腸道健康的重要指標(biāo)。絨毛高度增大，隱窩深度減小，絨隱比增大，給腸道提供了更大表面積，增強營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，其中上皮細(xì)胞充分成熟，功能也越活躍。相反，較短的絨毛和較深的隱窩，則降低腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，可能導(dǎo)致對疾病的抵抗力下降[25]。

郝洋洋[26]研究報道，400 g/t茶多酚能顯著增加35日齡肉雞的空腸絨毛高度，21日齡的絨毛高度以及絨隱比有增加的趨勢，在一定程度上增加了空腸的表面積，促進了空腸的發(fā)育，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率。孫丹鳳[27]研究表明，150 mg/kg茶多酚提高肉鴨回腸的絨毛高度，顯著增加了絨隱比，增加回腸絨毛表面積。Ding等[28]通過在育肥豬飼糧中添加茶葉殘渣增加了絨隱比，從而提高飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率，同時保持豬腸道黏膜的完整性，提高機體的免疫力。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，即馬崗鵝飼糧中添加適宜劑量的茶多酚，改善了空腸的形態(tài)發(fā)育，有助于提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。

腸道黏膜上皮細(xì)胞間通過緊密連接形成重要的物理屏障，其能夠阻止病原體和大分子物質(zhì)通過，緊密連接的表達可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞滲透性和維持細(xì)胞極性，對先天免疫至關(guān)重要[29]。ZO-1是腸上皮細(xì)胞緊密連接的支架蛋白，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜表面，作為樞紐，可以與胞質(zhì)內(nèi)的Claudins、Occludin等連接，其表達的大小影響細(xì)胞間緊密連接的形成，間接影響腸黏膜的防御屏障作用。Occludin主要位于緊密連接結(jié)構(gòu)內(nèi)，是一種分子質(zhì)量為65 kD的跨膜蛋白，在細(xì)胞間發(fā)揮黏附分子的作用，對于緊密連接功能具有維持和調(diào)節(jié)作用[30]。Claudin-5是腸上皮細(xì)胞的重要因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的通透性，在維持腸黏膜屏障的穩(wěn)定方面發(fā)揮作用。當(dāng)Claudin-5表達下降時，腸道的緊密連接功能也隨之下降，導(dǎo)致腸道的通透性增加[31]。E-cadherin是維持上皮細(xì)胞間連接的糖蛋白[32]，其介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附在維持細(xì)胞極性以及環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵的作用[33]。付晶等[10]研究表明，茶多酚可通過提高乳鴿十二指腸Occludin、ZO-1和閉合蛋白-3(Claudin-3)mRNA相對表達量，維持乳鴿腸黏膜的完整性和降低腸道的通透性。張雨晨[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加綠茶粉能夠上調(diào)小鼠小腸組織緊密連接蛋白閉合蛋白-1(Claudin-1)、ZO-1和OccludinmRNA相對表達量，增加小鼠腸道的機械屏障，緩解其因脂多糖誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激。朱晟易等[35]研究證實，普洱茶對非酒精性脂肪性肝病的大鼠腸道的緊密連接有一定程度的調(diào)控作用，可通過上調(diào)大鼠小腸黏膜Occludin和ZO-1基因表達水平，進一步加強小鼠小腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，起到預(yù)防和改善非酒精性脂肪性肝病的作用。以上研究結(jié)果與本研究相似，飼糧添加茶多酚可以通過促進腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達，增強腸道上皮細(xì)胞的緊密連接，對馬崗鵝腸道的機械屏障功能具有一定的維持作用。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，飼糧添加一定劑量的茶多酚，可以提高馬崗鵝空腸的抗氧化能力、促進腸道發(fā)育并維持緊密連接的程度。綜合考慮，在70日齡馬崗鵝飼糧中添加500 mg/kg茶多酚的效果相對更好。