不同產(chǎn)地黨參中小分子類化學成分差異比較分析研究

＊黃延盛 張欣 劉耀軍 胡流云 黃曉君

（1.無限極（中國）有限公司 廣東 510623 2.南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室 中國-加拿大食品科學與技術(shù)聯(lián)合實驗室江西省生物活性多糖實驗室 江西 330047）

黨參作為常用的傳統(tǒng)補益類食藥兩用材料，其主要部位為干燥根，在我國已有數(shù)百年的歷史[1-2]。《本草從新》等歷代著作均有記載[3]。黨參屬Codonopsis隸屬桔?？艭arnpanulaceae，全屬共40余種，我國有39種[4]，野生黨參主要分布于西南各省區(qū)，栽培黨參則主產(chǎn)于西北、華北地區(qū)。本屬植物黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.、素花黨參C.pilosula var.modesta(Nannf.)L.T.Shen及川黨參C.tangshen Oliv.為2010版《中國藥典》收載品種，其干燥根具有補中益氣，健脾益肺之功效[5]。常用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等癥。黨參屬大多數(shù)種類的根部都具有功效作用，一些種類如管花黨參C.tubulosa Kom.、球花黨參C.subglobosa Srnith、灰毛黨參C.canescens Nannf、新疆黨參C.clematidea(Schrenk)Clarke等也作為黨參使用?，F(xiàn)代研究表明，黨參多糖亦具有保護胃黏膜、調(diào)節(jié)人體免疫[6]、改善胃腸炎癥的作用[7]。黨參炔苷具有降低胃黏膜的損傷[8]、促進神經(jīng)的發(fā)育和抑制腫瘤的作用[9-10]。蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ具有改善腸道的炎癥[11]、抑制腫瘤[12]、減緩損傷[13]等作用。

黨參的小分子化合物研究也較為充分。國內(nèi)外學者相繼對黨參、纏繞黨參、川黨參、新疆黨參等黨參屬植物的化學成分進行了大量研究，從中分離到苷類、萜類、生物堿、揮發(fā)油、有機酸、黃酮類、酯類、糖類、氨基酸、微量元素及其他成分。如苷類化合物有黨參炔苷、黨參苷I、II、III、IV和丁香苷等；萜類化合物蒼術(shù)內(nèi)酯III、蒼術(shù)內(nèi)酯II、蒲公英萜醇乙酸醋、蒲公英萜醇、木栓酮等；生物堿類化合物黨參堿和黨參次堿；黃酮類化合物芹菜素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木樨草素、朝薊糖苷、木樨草素-7-O-蕓香糖苷及木樨草素-7-O-半乳糖苷等[14-19]。

黨參在我國分布廣泛，但不同地區(qū)地理環(huán)境、氣候條件等差異導致適宜生長的黨參品種不同。本研究通過對不同產(chǎn)地不同品種黨參小分子類化學成分差異進行比較分析研究，因此對我國主要產(chǎn)區(qū)的黨參的主要小分子化學成分進行分析比較就顯得尤為重要。甘肅、貴州、山西、湖北、四川為黨參的主要產(chǎn)區(qū)，本研究對這五個產(chǎn)地的黨參的香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III4種黨參標志性小分子成分進行全面分析，比較主要成分含量及差異，為不同產(chǎn)地品種黨參資源的有效開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)[20-23]。

1.材料與方法

(1)材料與試劑

黨參，35批黨參主要來源于甘肅、貴州、山西、湖北、四川等黨參主產(chǎn)區(qū)，包括2020版《中國藥典》收錄的3種黨參；黨參C.pilosula.；素花黨參C.pilosula var.mdesta.；川黨參C.tangshen.。由上海中藥標準化研究中心鑒定，其性狀與2020年版《中國藥典》所規(guī)定的黨參一致，鑒定為正品。

乙酸乙酯、甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；紫丁香苷（批號：110754-202023）、阿魏酸（批號：210473-202015）、蒼術(shù)內(nèi)酯III（批號：321626-202011）（純度≥98%，上海中藥標準化研究中心）；黨參炔苷對照品（批號：RFS200109）（純度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；超純水，MILLI-Q超純水制備儀制備。

(2)儀器與設備

KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；PB203-N電子天平（上海分析儀器廠）；PBL-M型離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；METTLER 200型電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Waters ZQ 2000型超高效液相色譜儀，Masslynx V4.1色譜工作站包，括Waters Acquity PDA二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；色譜柱：Acquity UPLC?HSS T3 Column（1.8um×2.1×100mm）（美國Waters公司）。

(3)方法

①樣品前處理

每個產(chǎn)地黨參樣品中挑選200g無霉變、外觀良好的黨參用粉碎機粉碎，過3號篩備用。

②黨參小分子成分測定

A.標準液的配制

分別稱取紫丁香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III 4種黨參標準品6.32mg、10.12mg、8.14mg、9.67mg，使用甲醇溶解定容于25mL的量瓶中，作為貯備液，貯備液濃度分別為紫丁香苷0.2528mg·mL-1，阿魏酸0.4048mg·mL-1，黨參炔苷0.3256mg·mL-1，蒼術(shù)內(nèi)酯III 0.3868mg·mL-1。吸取適量上述4種標準品貯備液于50mL量瓶中，作為稀釋一系列不同濃度標準溶液的原液。

B.樣品前處理

取黨參粉末（粉末過3號篩），約0.5g精密稱定。置100mL具塞錐形瓶中，加20mL乙酸乙酯，超聲提?。üβ?50W，頻率40kHz）30min；過濾，收集乙酸乙酯提取液，置25mL梨形瓶中，減壓濃縮至干；藥渣再加80%甲醇溶液，超聲提取（功率250W，頻率40kHz）50min；收集醇提液，置25mL梨形瓶中，減壓濃縮至干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，過0.22μm濾膜，取續(xù)濾液進UPLC，進樣量5μl。

C.色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC?HSS T3 Column（1.8μm×2.1×100mm）。流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，0～14min，0.5%～20%（A）；14～18.5min，20%～30%（A）；18.5～23min，30%～50%（A）；23～30min，50%～98%（A）；30～32min，98%（A）；32～34min；98%～0.5%（A）。流速0.2mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長240nm。該色譜條件下，各檢測組分分離度良好，見圖1。

2.結(jié)果與分析

(1)檢測方法學驗證

①線性關系的考察

精密吸取對照品貯備液，制成一系列不同濃度的混合對照品溶液，每種濃度的對照品溶液進樣5μL分析，以進樣量（μg）對峰面積積分值進行線性回歸，結(jié)果表明各成分在相應的范圍內(nèi)，線性關系良好，見表1。

表1 紫丁香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III的線性范圍

②精密度試驗

取高、中、低三種濃度的混合標準品溶液，進樣量5μL，重復進樣6次，測定峰面積，計算得知RSD在合理范圍內(nèi)，表明日內(nèi)精密度良好。數(shù)據(jù)見表2～表5。連續(xù)三天測試，計算日間精密度結(jié)果，得知RSD小于3%，表明其日間精密度良好，數(shù)據(jù)見表6。

表2 紫丁香苷日內(nèi)精密度測定結(jié)果(n=6)

表3 阿魏酸日內(nèi)精密度測定結(jié)果(n=6)

表4 黨參炔苷日內(nèi)精密度測定結(jié)果(n=6)

表5 蒼術(shù)內(nèi)酯III日內(nèi)精密度測定結(jié)果(n=6)

表6 日間精密度測定結(jié)果

③重復性試驗

取黨參12號（十里鎮(zhèn)示范園試驗田）細粉約0.5g，按供試品溶液方法制備6份，按上述色譜條件檢測，計算紫丁香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III單位質(zhì)量峰面積的RSD為2.40%、2.24%、1.96%和2.85%，說明方法重復性良好，結(jié)果見表7。

表7 重復性試驗結(jié)果

④穩(wěn)定性試驗

取13號黨參（十里鎮(zhèn)示范園試驗田）細粉約0.5g，精密稱定，按“供試品溶液制備”項下操作，在上述色譜條件下，分別于0、3h、5h、7h、11h、18h、24h、36h測定，測得紫丁香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III的單位質(zhì)量峰面積如下表，計算峰面積的相對標準偏差為RSD為1.74%、2.27%、1.08%、1.21%，結(jié)果見表8，表明樣品溶液36h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表8 穩(wěn)定性測定結(jié)果

⑤加樣回收率試驗

取12號黨參細粉9份，每份約0.25g，精密稱定，分別按已知含量的80%、100%、120%分別加入紫丁香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III對照品溶液，每一比例平行做3份，按“供試品溶液制備”項下操作。在上述色譜條件下進樣測定，加樣回收率都在合理范圍內(nèi)，結(jié)果見表9～表12。

表9 紫丁香苷加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

表10 阿魏酸加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

表11 黨參炔苷加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

表12 蒼術(shù)內(nèi)酯III加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

(2)樣品測定結(jié)果

稱取各批次黨參細粉約0.5g，精密稱定，按“供試品溶液制備”項下操作，制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5μL注入UPLC色譜儀，各物質(zhì)含量測定結(jié)果見表13。

表13 不同批次樣品含量測定結(jié)果(n=2)

(3)樣品分析與討論

由圖2可以看出黨參炔苷為黨參共性成分，含量也是4種成分中相對較多的，含量最高為S12號樣品，含量為1.33mg·g-1；最低為S31號樣品，含量為0.19mg·g-1，約為S12號樣品的十分之一。從產(chǎn)地來看，屬于同一基源的S1～S19號樣品由于產(chǎn)地不同，黨參炔苷含量也存在差異，其中S1～S10號樣品主要為來自甘肅文縣的紋黨（S1、S2），以及甘肅省渭源縣不同村落的白條黨參（S3～S10），這幾批黨參炔苷含量較S11～S19號樣品低，究其原因可能是基地種植品多使用壯根靈，對黨參生長存在影響?；磳儆诖h參的S20～S28樣品黨參炔苷含量居中，含量都在0.5mg·g-1；產(chǎn)自山西省的S29～S34樣品以及貴州威寧的S35號樣品在黨參基源上屬于黨參，黨參炔苷含量在三種黨參中含量偏低，含量約為0.3mg·g-1。其中S29和S30為一組對照組，未施過農(nóng)藥的S29號樣品黨參炔苷的含量約為施過農(nóng)藥的S30的2倍，推測農(nóng)藥的使用對黨參炔苷的含量也有一定的影響，農(nóng)藥使用量越大，黨參炔苷的含量越低；S33為產(chǎn)自山西省屯留縣河廟鄉(xiāng)砍套村的野生黨參，黨參炔苷含量為0.7mg?g-1。

圖2 35批黨參含測量結(jié)果

蒼術(shù)內(nèi)酯III含量最高為S16號樣品，含量約為0.64 mg?g-1；S7號樣品含量僅為0.04mg?g-1；從表中可以看出蒼術(shù)內(nèi)酯III僅在樣品S1～S19和樣品S29～S35中含有，這說明蒼術(shù)內(nèi)酯III僅在素花黨參和黨參中含有，而產(chǎn)自湖北恩施的S20～S24，四川巫山的S25、S26樣品都未檢測到蒼術(shù)內(nèi)酯III，同樣屬于同一基源素花黨參的S1～S19號樣品也由于產(chǎn)地不同，蒼術(shù)內(nèi)酯III含量也存在差異，種植在甘肅省渭源縣黨參十里鎮(zhèn)的S12～S19號樣品蒼術(shù)內(nèi)酯III含量比產(chǎn)自甘肅文縣的紋黨（S1、S2），以及甘肅省渭源縣的白條黨參（S3～S10）含量高1～2倍，含量都在0.2～0.3mg?g-1，可能是基地種植品多使用壯根靈，對黨參生長存在影響。

紫丁香苷和阿魏酸含量均較低，含量范圍分別為0.0084～0.2926mg?g-1、0.0027～0.0699mg?g-1，含量均接近千分之一；其中基地種植品紫丁香苷含量均高于其它批次素花黨參、川黨參和黨參；S33為產(chǎn)自山西省屯留縣的野生黨參，阿魏酸含量是35批黨參中含量最高的，約為0.07mg?g-1。

綜上，4種物質(zhì)含量為黨參炔苷＞蒼術(shù)內(nèi)酯III＞紫丁香苷＞阿魏酸；所含4種成分素花黨參＞黨參＞川黨參；同時可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地與含量的關系為甘肅渭源（基地種植）＞山西陵川＞湖北恩施。

3.結(jié)論

本研究全面系統(tǒng)收集我國主要黨參產(chǎn)區(qū)（甘肅、貴州、山西、湖北、四川）的不同品種（黨參C.pilosula.；素花黨參C.pilosula var.mdesta.；川黨參C.tangshen.）的黨參樣品，并對其中的特征小分子類化學成分含量進行了比較分析，除了黨參炔苷和蒼術(shù)內(nèi)酯III外新增了紫丁香苷、阿魏酸小分子含量比較研究。結(jié)果表明，4種物質(zhì)含量為黨參炔苷＞蒼術(shù)內(nèi)酯III＞紫丁香苷＞阿魏酸。其中黨參炔苷為黨參共性成分，含量也是4種成分中含量相對較多的成分，含量最高的為甘肅文縣十里鎮(zhèn)示范園試驗田黨參樣品，且黨參產(chǎn)地不同導致黨參炔苷含量也存在顯著差異。從品種來看，素花黨參小分子含量最多，黨參次之，川黨參最低。從產(chǎn)地來看，甘肅渭源（基地種植）黨參小分子含量最高，山西陵川黨參小分子含量次之，湖北恩施黨參小分子含量最低。通過對主要產(chǎn)地和品種黨參小分子含量的分析及比較，為后續(xù)選擇適宜品種黨參作為食品或加工原料時提供一定的理論參考。