瑞香狼毒化感物質釋放的時間和空間變化規(guī)律研究

＊基輝 程濟南 程錦春 楊曉燕 關基鳳 秦波*

（1.中國科學院蘭州化學物理研究所中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室/甘肅省天然藥物重點實驗室 甘肅 730000 2.煙臺中科先進材料與綠色化工產業(yè)技術研究院 山東 264006 3.蘭州大學草地農業(yè)科技學院 甘肅 730000 4.西北民族大學化工學院 甘肅 730000 5.內蒙古通遼市市場檢驗檢測中心 內蒙古 028000）

植物根系、根際微生物和根際土壤的相互作用，構成了植物根際微生態(tài)系統(tǒng)。外來植物入侵會引起土壤生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生改變，形成有利于入侵植物生長的土壤生態(tài)系統(tǒng)，進而形成單優(yōu)勢植物群落并快速擴張蔓延[1]。在這一過程中，化感作用發(fā)揮著不可替代的作用?；凶饔檬且环N生物體相互干擾的生態(tài)現(xiàn)象，主要用于控制雜草、抗病蟲害以及改善土壤營養(yǎng)與微生物的相互作用[2]。入侵植物在入侵過程中產生一系列化感物質，從而發(fā)揮較強的化感作用，成為植物和土壤之間相互作用的調節(jié)者[3]。近些年，許多入侵成功的植物在入侵過程中都伴隨著強烈的化感作用，化感作用成為入侵植物加速擴張、抑制本土植物生長的有力武器[4]。入侵植物的化感作用，在學者探究外來植物入侵機制中得到越來越多的關注。

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬多年生草本植物，在中國廣泛分布于甘肅、新疆、寧夏等地區(qū)，是我國西北高寒草地的主要有毒雜草之一，近年來，瑞香狼毒由于強大的生態(tài)適應性和高度的競爭性，目前已成為中國草地退化的標志性植物之一[5]?，F(xiàn)今對于瑞香狼毒的研究，多集中在形態(tài)學、化學活性、生物防治等方面，而瑞香狼毒的化感作用研究報道較少。在前期研究中，共分離鑒定出瑞香狼毒的7種化感物質，并明確了瑞香狼毒化感物質隨地理分布的變化規(guī)律。然而對于瑞香狼毒化感物質的報道，更多的是集中在單個化感物質的提取及活性測定等方面[6]。迄今為止，未見有對不同生長時期、不同蓋度下，瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質種類、含量及變化規(guī)律的研究報道。本文采用高效液相色譜測定瑞香狼毒根際土壤及根中化感物質，探究化感物質種類和含量的時空變化規(guī)律。本研究對于控制瑞香狼毒種群蔓延，治理瑞香狼毒引起的草地退化問題具有重要意義，也為瑞香狼毒的生物防控提供理論基礎。

1.材料與方法

(1)材料和樣地

實驗樣地位于祁連山東麓天然草原，甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)炭窯溝村（37°7′36″N，102°50′3″E），屬于亞高山和高山屬寒冷濕潤氣候。選擇5月中旬—6月中旬瑞香狼毒展葉期（Leaf emergence，LE），6月中下旬—8月初盛花期（Full bloom，F(xiàn)B），8月中旬—9月中下旬果實成熟期（Seed maturation，SM），10月初—第二年5月中旬休眠期（Dormancy period，DP），共4個生長時期進行樣品采集。依據瑞香狼毒生長蓋度分別為0%、25.1%、52.6%以及89.7%選擇樣地，每個樣地重復四次，樣地信息見表1。不同樣地之間間隔50m以上。每個樣地挖取6株健康瑞香狼毒植株，先輕輕抖落根圍土塊，再用無菌毛刷收集粘附在根表的土壤，即為瑞香狼毒根際土壤，每個重復的根際土壤和根樣品分別混合成一個樣品，帶回實驗室4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣地信息表

(2)標準曲線的制作

瑞香狼毒7種化感物質傘形花內脂、狼毒色原酮、西瑞香素、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素的標準品購買于武漢天植生物技術有限公司（www.chemfaces.com）。將單個化感物質標準品溶于色譜甲醇，配置成2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL的6個質量濃度梯度標準液，再配置7種化感物質混合液一份。通過對洗脫程序、檢測波長、流速的篩選，最終確定瑞香狼毒化感物質高效液相色譜條件如下：色譜柱：250mm×4.6mm、5μm粒徑的Symmetry C18反相柱；檢測波長為300nm；流動相流速：1mL/min；流動相：A相為乙腈，B相為含0.2%乙酸的水；進樣量：20μL；洗脫梯度：0～6min：20%～30% A；6～8min：30%～35% A；8～15min：35～45% A；15～18min：45～60% A；18～20min：60～80% A；20～25min：80% A。將6個梯度的標準液通過高效液相色譜儀進行峰面積測定，每個質量濃度重復3次。以各質量濃度峰面積平均值為縱坐標，濃度為橫坐標制作標準曲線，R2在0.999以上滿足要求。建立7種化感物質標準曲線y=ax+b；其中：x為所測樣品質量濃度，單位μg/mL；y為高效液相色譜儀器檢測出的峰面積（表2）。在上述色譜條件下，傘形花內脂、狼毒色原酮、西瑞香素、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A的出峰保留時間分別為：8.5min、15.6min、16.1min、16.6min、18.6min、19.4min、20.4min。

表2 瑞香狼毒化感物質標準曲線

(3)瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質的測定

瑞香狼毒根際土壤于室內陰干后，過40目篩（孔徑0.425mm）除去石頭、草根等雜質。瑞香狼毒根際土壤樣品中按照每100g土樣加入300mL的甲醇溶液（m:v=1:3），超聲提取30min以上，重復3次；經抽濾除雜后，獲得根際土壤粗提溶液A；所述根際粗提溶液A使用旋轉蒸發(fā)儀除去甲醇后，即得根際土壤粗提物B。瑞香狼毒植株根室內陰干后，通過粉樣機粉碎后，稱取50g根粉末，加入150mL甲醇溶液（m:v=1:3），超聲提取30min以上，重復3次，得到根粗提溶液E；所述根粗提溶液E通過使用旋轉蒸發(fā)儀除去甲醇后，即得根粗提物F。

分別稱取根際土壤粗提物B和根粗提物F，加入色譜級甲醇溶液，配制成2mg/mL的溶液，并通過0.22μm的有機濾膜除去雜質，得到待測溶液C和待測溶液D。采用高效液相色譜（HPLC）分別對待測溶液C和D進行檢測，通過外標法確定瑞香狼毒化感物質保留時間。通過比對化感物質標準曲線峰面，進行換算即得瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質含量。瑞香狼毒根際土壤和根粗提物中，單個化感物質質量M=V?A（y-b）/（a?A1），A1=V?w，式中：V為每次進樣的體積，單位μL；A為粗提物總質量，單位g；A1為每次進樣的消耗樣品質量，單位mg；w為進樣濃度，單位mg/mL。

(4)數據處理

瑞香狼毒化感物質數據處理使用Excel 2016軟件進行，通過SPSS 26.0進行方差檢驗，使用Origin 2018對數據進行可視化處理。

2.結果與分析

(1)瑞香狼毒根際土壤化感物質隨生長季節(jié)與蓋度的變化

瑞香狼毒根際土壤樣品中共檢測出5種化感物質，分別為狼毒色原酮、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B以及7-甲氧基新狼毒素A。如圖1所示，每千克根際土壤中，展葉期以及盛花期瑞香狼毒化感物質含量顯著高于結實期以及休眠期。瑞香狼毒展葉期89.7%種群蓋度下，根際土壤中每種化感物質含量最高；休眠期25.1%種群蓋度下瑞香狼毒根際土壤化感物質含量最低。根際土壤中5種化感物質含量在展葉期、結實期以及休眠期隨著瑞香狼毒種群蓋度增加而增加；在瑞香狼毒盛花期根際土壤中化感物質含量各異，表現(xiàn)為52.6%種群蓋度下各化感物質含量最高，而新狼毒素B則隨著種群蓋度增加而降低。如圖2所示，瑞香狼毒根際土壤化感物質含量隨著生長季節(jié)的變化，呈現(xiàn)下降的趨勢，展葉期根際土壤中化感物質含量最高，休眠期化感物質含量最低。

圖1 瑞香狼毒根際土壤化感物質含量變化規(guī)律

圖2 不同種群蓋度瑞香狼毒根際土壤化感物質含量隨生長階段的變化趨勢

(2)瑞香狼毒根中化感物質隨生長季節(jié)與蓋度的變化

瑞香狼毒不同生長季節(jié)、不同種群蓋度根部樣品中共檢測出7種化感物質（圖3）。50g瑞香狼毒根中所得化感物質含量顯著高于每千克根際土壤中的化感物質含量。展葉期以及盛花期瑞香狼毒根中化感物質含量顯著高于果實成熟期以及休眠期。根中新狼毒素B含量最高，傘形花內脂含量最低。盛花期根中傘形花內脂含量明顯高于其他生長季節(jié)，總體上根中傘形花內脂含量遠遠低于其余6種化感物質。根中狼毒色原酮含量在展葉期以及盛花期隨著種群蓋度增加而增加。展葉期西瑞香素含量明顯高于其它生長階段，呈現(xiàn)隨種群蓋度增加而降低的趨勢；其余生長時期西瑞香素含量則表現(xiàn)為隨種群蓋度增加而增加的趨勢。各生長季節(jié)的52.6%種群蓋度下的異新狼毒素A在含量差異較大，而展葉期和盛花期的新狼毒素B含量遠高于其它階段及其它種群蓋度。瑞香狼毒根中二氫瑞香素B在各生長階段及52.6%種群蓋度下含量最高，但在休眠期隨種群蓋度增加而呈下降趨勢。7-甲氧基新狼毒素A在展葉期以及盛花期瑞香狼毒根中含量較為接近，但在展葉期52.6%種群蓋度的土壤樣品中含量最低。瑞香狼毒根中化感物質含量隨著生長季節(jié)的變化，呈現(xiàn)下降的趨勢，展葉期根中化感物質含量最高，休眠期根中化感物質含量最低，但傘形花內脂則是在盛花期階段根中含量最高（圖4）。

圖3 瑞香狼毒根中化感物質含量變化規(guī)律

圖4 不同種群蓋度瑞香狼毒根中化感物質含量隨生長階段的變化趨勢

3.討論

瑞香狼毒作為西北天然草地主要的入侵毒草之一，其根含有劇毒，嚴重影響著我國西北草地的生產力以及畜牧業(yè)[7]。化感物質是瑞香狼毒入侵競爭的重要手段之一，前期研究證明，瑞香狼毒化感物質會抑制瑞香狼毒周圍牧草的生長[8]。在瑞香狼毒根際土壤中檢測出5種化感物質。在瑞香狼毒根的粗提物中，7種化感物質均檢測出來。瑞香狼毒化感物質含量在展葉期以及盛花期中多于結實期以及休眠期。狼毒色原酮、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A在根際土壤及根中含量較高，根際土壤中5種化感物質含量在展葉期、結實期以及休眠期隨著瑞香狼毒生長蓋度增加而增加，而在根中化感物質含量則表現(xiàn)各異，可能是因為瑞香狼毒植株對其化感物質的影響較大。此外，對比瑞香狼毒根中化感物質含量，發(fā)現(xiàn)傘形花內脂以及西瑞香素含量較低，而瑞香狼毒釋放到土壤中含量也較少，這可能是其在根際土壤中無法檢測出的原因。西瑞香素在展葉期中隨著生長蓋度的增加含量呈下降趨勢，其后三個生長時期大致呈現(xiàn)隨蓋度增加而含量增加的趨勢，Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素只在植株幼苗階段促進生根的作用，因此西瑞香素可能是在瑞香狼毒入侵的最初階段發(fā)揮作用。隨著生長時期的變化，根際土壤以及根中化感物質含量呈現(xiàn)一個逐漸下降的趨勢，展葉期根中化感物質含量高于其余3個生長時期，這與該時期瑞香狼毒生長活性及根系合成和釋放能力強有關[10]。植物根系釋放有機物質的含量，受到植物內部及外部條件的影響，如營養(yǎng)狀況、根際pH、土壤微生物等的影響[11]，這可能是盛花期根際土壤中和根中各個時期化感物質含量趨勢存在差異性的原因。

4.結論

在瑞香狼毒根際土壤中檢測出狼毒色原酮、異新狼毒素A、新狼毒素B、二氫瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A 5種化感物質，在瑞香狼毒根的粗提物中7種化感物質均檢測出來。瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質含量隨生長季節(jié)變化呈現(xiàn)下降趨勢，化感物質含量在展葉期以及盛花期中多于結實期以及休眠期。通過對瑞香狼毒根際土壤和根中化感物質隨生長季節(jié)和種群蓋度的變化規(guī)律研究，對于控制瑞香狼毒在天然草地的種群蔓延，治理瑞香狼毒引起的草地退化問題具有重要意義。