楝酰胺對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用及其機(jī)制

楚蕾蕾，高國(guó)偉，楊楨楨，楊留勤，武莉萍

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2 新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院放療科

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見的癌癥，同時(shí)也是全球第三大癌癥死亡的原因。原發(fā)性肝癌是導(dǎo)致全球男性死亡的因素第二位［1］。多數(shù)原發(fā)性肝癌患者確診時(shí)病情已進(jìn)展至晚期，預(yù)后不良［2］。原發(fā)性肝癌的易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者生存率不高的主要原因［3］。分子靶向藥物和免疫制劑的研究成為肝癌治療的熱點(diǎn)［4］，進(jìn)一步研究［5］發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的代謝重編程可能與其耐藥性密切相關(guān)。在一項(xiàng)動(dòng)物模型研究［6］中發(fā)現(xiàn)，抑制已糖激酶Ⅱ（HK2）表達(dá)可減少肝癌細(xì)胞的增殖，且對(duì)小鼠沒有明顯不良反應(yīng)。與人正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)HK2，而沉默HK2 表達(dá)可不僅癌細(xì)胞的凋亡，抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展［7］。楝酰胺（Rocaglamide，Roc-A）是一類從米仔蘭植物屬中提取的一種抗腫瘤物質(zhì)［8］，其抗腫瘤活性的報(bào)道最早可追溯到1973 年［9］。Roc-A 不僅具有抗炎、保護(hù)正常組織免受損傷等作用，還具有特異性抑制腫瘤生長(zhǎng)和選擇性保護(hù)正常細(xì)胞的雙重作用。Roc-A 可通過(guò)抑制熱休克因子（HSF1）表達(dá)，使硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）表達(dá)增加引起葡萄糖攝取減少來(lái)抑制糖酵解；還通過(guò)激活MAPK p38 和JNK信號(hào)通路及抑制Ras-CRaf-MEK-ERK 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。近年來(lái)已有多項(xiàng)研究深入探討Roc-A抗腫瘤活性的具體作用機(jī)制，但Roc-A 是否通過(guò)抑制HK2 表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡相關(guān)研究較少。2020 年6 月-2021 年8 月，我們觀察了加入不同濃度Roc-A 培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞的凋亡情況，并對(duì)其可能作用機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人肝癌細(xì)胞株HepG2 購(gòu)自賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；Roc-A 購(gòu)自Med-ChemExpress 公司（64166）；二甲基亞砜購(gòu)自北京索萊寶公司（1129E035）；MEM 培養(yǎng)基、PBS 購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；胎牛血清購(gòu)自澳洲Invigentech 公司；YF488-Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自US Everbright Inc；HK2（DF6176）、抑凋亡因子類似物（BCL2L1，AF6139）、β-actin（AF7018）購(gòu)自Affinity 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司；cDNA合成試劑盒（00983513）購(gòu)自Takara 公司（00983513）；HK2、BCL2L1 引物序列購(gòu)自金唯智公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、臺(tái)式高速常溫離心機(jī)、熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；Q Exactive 質(zhì)譜儀、Orbitrap Fusion 質(zhì)譜儀、Q Exactive HF 質(zhì)譜儀購(gòu)自ThermoFisher 公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；電泳儀、電泳槽購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司；PCR 儀購(gòu)自France公司。

1.2 加入不同濃度Roc-A 培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用YF488-Annexin V/PI 熒光雙染法。取適量HepG2 細(xì)胞，置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的MEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1 次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右，胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，按1：3 比例傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)于6孔板，分為5組，分別加入0（空白對(duì)照）、25、50、100、200 nmol/L的Roc-A溶液，培養(yǎng)24 h時(shí)取各組細(xì)胞，加Annexin V的結(jié)合緩沖液、YF488-Annexin V 和PI 的混合液共50 μL，避光孵育30 min，沖洗，加Hochest 20 μL，避光孵育15 min，在合適的熒光下用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞凋亡情況胞。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞HK2、BCL2L1 mRNA 檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞，分為2 組，分別加入0（空白對(duì)照）、100 nmol/L 的Roc-A 溶液，培養(yǎng)24 h 時(shí)取2 組細(xì)胞，RT-qPCR 法檢測(cè)HK2、BCL2L1 mRNA。RNA試劑盒提RNA，cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，熒光染料SYBR 進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)作圖，生成擴(kuò)增曲線。HK2 引物序列：上游引物5′-GAGCCACCACTCACCCTACT-3′，下游引物5′ -CCAGGCATTCGGCAATGTG-3′。BCL2L1 引物序列：上游引物5′-GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，下游引物5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′。β-actin 引物序列：上游引物5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′，下游引物5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′。以2-ΔΔCt（Ct 代表循環(huán)閾值）值表示代表HK2、BCL2L1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞HK2、BCL2L1 蛋白檢測(cè) ①取適量HepG2 細(xì)胞，分為3組，分別加入0（空白對(duì)照）、100、200 nmol/L的Roc-A，培養(yǎng)24 h 提取樣品，進(jìn)行超聲裂解、丙酮沉淀、酚抽提，測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白酶解與TMT 標(biāo)記，質(zhì)譜上機(jī)與數(shù)據(jù)處理，采用蛋白組學(xué)質(zhì)譜分析（TMT）法對(duì)樣品進(jìn)行LC-MS/MS 分析。用Foldchange 來(lái)評(píng)估蛋白在樣品間的表達(dá)水平變化倍數(shù)，經(jīng)t檢驗(yàn)計(jì)算的P值表現(xiàn)蛋白間差異的顯著程度（差異篩選條件：Foldchange≥1.5 倍且P＜0.05），將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。②采用Western Blotting 法檢測(cè)HK2、BCL2L1蛋白。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞分為5 組，分別加入0、25、50、100、200 nmol/L 的Roc-A 溶液，培養(yǎng)24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，冰上裂解離心，提取上清蛋白，BCA 法測(cè)濃度，取樣品50 μg，上樣電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，加一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜，加二抗（1∶10 000），顯影，用Image J 軟件測(cè)蛋白的灰度值，以目的條帶與β-actin 條帶灰度值比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值

1.5 癌組織HK2 表達(dá)與肝癌患者的生存時(shí)間關(guān)系分析 采用Kaplan Meier Plotter 癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)分析癌組織HK2 表達(dá)與肝癌患者生存時(shí)間的關(guān)系。Kaplan Meier Plotter癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//kmplot.com/analysis），它是對(duì)21 種腫瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌）超過(guò)54 000 個(gè)基因（數(shù)據(jù)類型包括芯片數(shù)據(jù)、高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，涉及mRNA、miRNA、蛋白和DNA）進(jìn)行生存分析。其數(shù)據(jù)主要來(lái)源于GEO、EGA 和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Kaplan-Meier 算法分析癌組織HK2 表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后之間的關(guān)系［11］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件、Graphpad prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用P-P 圖檢驗(yàn)資料的正態(tài)性，成正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組均數(shù)間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用［M（P25，P75）］表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；生存曲線用Kaplan-Meier 法繪制，采用Log-ranktest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 加入不同濃度Roc-A 培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞凋亡率比較 加入0、25、50、100、200 nmol/L 的Roc-A 溶液HepG2 的細(xì)胞凋亡率分別為0.83% ± 0.21%、9.46% ± 2.34%、24.68% ± 4.22%、39.60% ±2.16%及58.63%±1.62%，組間兩兩比較，F(xiàn)=8 807，P＜0.05。

2.2 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞HK2、BCL2L1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 培養(yǎng)24 h時(shí)，加入0、100 nmol/L Roc-A 溶液的HepG2 細(xì)胞HK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.02 ± 0.02、0.16 ± 0.05（t=63.39，P＜0.05）；BCL2L1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.05、0.17±0.08（t=52.32，P＜0.05）。

2.3 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞HK2、BCL2L1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 TMT 法檢測(cè)加入0、100、200 nmol/L Roc-A 的HepG2細(xì)胞HK2蛋白相對(duì)表 達(dá)量 分 別為1.29 ± 0.02、0.79 ± 0.02、0.85 ±0.03，組間兩兩比較，F(xiàn)=10 932，P＜0.05；BCL2L1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.49 ± 0.07、0.77 ± 0.06、0.84±0.03，組間兩兩比較，F(xiàn)=155.3，P＜0.05。

WESTERN Blotting 法檢測(cè)培養(yǎng)24 h 時(shí)加入0、25、50、100、200 nmol/L Roc-A 溶液培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞HK2 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.54±0.01、0.51±0.04、0.22 ± 0.01、0.13 ± 0.02、0.15 ± 0.03，組間兩兩比較，F(xiàn)=3158，P＜0.05。加入0、25、50、100、200 nmol/L Roc-A 溶液培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞BCL2L1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.86 ± 0.08、0.75 ± 0.04、0.45±0.03、0.35±0.04、0.30±0.02，組間兩兩比較，F(xiàn)=266.2，P＜0.05。

2.4 癌組織不同HK2 表達(dá)的肝癌患者生存時(shí)間比較 在Kaplan Meier Plotter 癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選3 099個(gè)數(shù)據(jù)。與癌組織HK2 高表達(dá)的肝癌患者比較，HK2 低表達(dá)的肝癌患者的生存時(shí)間更長(zhǎng)（P=0.0009）。

3 討論

1982年第一個(gè)生物活性物質(zhì)Roc-A被學(xué)者［12］從Aglaia elliptifolia 中分離出來(lái)，并在小鼠白血病模型中被證明能延長(zhǎng)生存時(shí)間。迄今為止，從30 多種Aglaia 物種中分離出了100 多種天然的環(huán)戊烷并苯并呋喃類化合物，其中一類Roc-A 被證明有抗腫瘤活性［13］，可通過(guò)將真核翻譯起始因子4A（eIF4A）作用于特定的RNA 序列之間的雙分子腔來(lái)發(fā)揮作用［8］。Roc-A不僅可以抑制癌細(xì)胞的增殖，也能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡［14-15］。除抗癌活性外，Roc-A 還能保護(hù)原代細(xì)胞免受化療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，減輕神經(jīng)元組織的炎癥和藥物誘導(dǎo)的損傷［10］。除此之外研究［16］還發(fā)現(xiàn)，Roc-A可選擇性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的能量代謝。

目前癌癥能量代謝成為抗腫瘤機(jī)制研究的熱點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞的能量代謝重編程還與化療耐藥密切相關(guān)［17］，并且能量代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的變化影響糖酵解過(guò)程和乳酸的產(chǎn)生，導(dǎo)致腫瘤耐藥性產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移［18］。而肝癌細(xì)胞可能是能量代謝重編程最全面的細(xì)胞［19］。最早發(fā)現(xiàn)的有氧糖酵解，主要參與肝癌的增殖、免疫逃逸、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥性的調(diào)控［20］。已糖激酶作為糖酵解的第一個(gè)限速酶，有四種亞型（HK1、HK2、HK3 和HK4），HK2 在肝癌組織中高表達(dá)，與病理分期和預(yù)后直接相關(guān)［21］。HK2 的過(guò)表達(dá)在許多類型的癌癥中一直被報(bào)道，如促進(jìn)乳腺癌［22］、胰腺癌［23］等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。我們通過(guò)分析KM-Plotter的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)肝癌患者中HK2 的表達(dá)與總生存時(shí)間有關(guān)，且HK2 表達(dá)水平越高的患者生存時(shí)間越短，因此HK2 的表達(dá)水平可能與其預(yù)后不良相關(guān)。抑制HK2的表達(dá)，使HK2和電壓依賴型陰離子通道蛋白1（VDAC-1）之間的相互作用被破壞，促凋亡蛋白Bax可以更有效地與細(xì)胞膜上的VDAC-1結(jié)合，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［24］。張宇等［25］發(fā)現(xiàn)，沉默HK2 表達(dá)可顯著降低HepG2 細(xì)胞增殖活性，顯著升高HepG2 細(xì)胞凋亡率。分化差的肝癌細(xì)胞HLE 中HK2低表達(dá)，HLE 細(xì)胞依賴谷氨酰胺進(jìn)行三羧酸循環(huán)，而分化良好的肝癌細(xì)胞HUH7 中HK2 高表達(dá)，這種細(xì)胞依賴葡萄糖和谷氨酰胺進(jìn)行三羧酸循環(huán)進(jìn)行能量代謝［26］。這說(shuō)明不同分化程度的肝癌細(xì)胞代謝方式有所不同。

最新研究［27］發(fā)現(xiàn)，手術(shù)切除的肝癌組織標(biāo)本中HK2 的表達(dá)明顯高于鄰近組織、正常組織，HK2 高表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后不良具有顯著相關(guān)性。過(guò)表達(dá)HK2 促進(jìn)乳糖代謝，細(xì)胞遷移侵犯，而敲除HK2基因完全相反，說(shuō)明HK2 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的糖酵解，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵犯、轉(zhuǎn)移等。HK2 siRNA 轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B能顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞葡萄糖和乳酸的消耗量，用雷帕霉素（mTOR 抑制劑）處理HepG2和Hep3B 能顯著下調(diào)HK2 mRNA 和HK2 蛋白以及葡萄糖和乳酸的消耗。這些結(jié)果提示mTORSTAT3-HK2 通路參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的糖酵解，這使得我們有可能通過(guò)干預(yù)肝癌細(xì)胞的糖酵解來(lái)治療肝癌患者［28］。核糖體RNA 加工蛋白15（RRP15）在肝癌細(xì)胞中明顯高表達(dá)，與預(yù)后不良顯著相關(guān)，基因敲除RRP15能抑制HCC 增殖，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均能證明這一點(diǎn)。

研究［29］發(fā)現(xiàn)RRP15 敲除使得肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞通過(guò)HK2 途徑改變能量攝取方式：未敲除基因的戊糖磷酸化變?yōu)榍贸蟮恼５木€粒體氧化磷酸化，這一變化導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。其他研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證相比正常細(xì)胞和組織，肝癌腫瘤組織和細(xì)胞HK2 高表達(dá)，用黃岑純化物藥物處理下調(diào)HK2 表達(dá)，能下降葡萄糖攝取能力，使得Bax 從細(xì)胞胞漿釋放入線粒體中，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。肝癌組織小鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)也證明這一點(diǎn)［30］。金雀異黃酮處理肝癌細(xì)胞研究［31］結(jié)果同上，金雀異黃酮抑制糖酵解誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞線粒體凋亡。有氧糖酵解促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并和預(yù)后不良密切相關(guān)，HK2 是有氧糖酵解的關(guān)鍵組成。組成型光形態(tài)建成信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體9（COP9）信號(hào)體復(fù)合體的第五組分（COPS5/CSN5）。沉默表達(dá)CSN5導(dǎo)致HK2蛋白明顯減少，抑制HK2 表達(dá)能抵消CSN5 的糖酵解作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HK2是糖酵解的關(guān)鍵，控制HK2的表達(dá)就能控制肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡［32］。穗花杉雙黃酮具有抗腫瘤活性，而對(duì)正常細(xì)胞的活性沒有明顯影響。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)［33］發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能通過(guò)下調(diào)HK2 來(lái)抑制肝癌細(xì)胞糖酵解。這兩者具有相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮通過(guò)ROS，抑制JAK2/STAT3通路來(lái)下調(diào)HK2的表達(dá)。

HK2 是糖酵解的關(guān)鍵，多種藥物和生物技術(shù)手段能通過(guò)下調(diào)HK2 的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤活性，抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。而我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Roc-A 通過(guò)抑制糖酵解的過(guò)程并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，并呈濃度依賴性，且證實(shí)HK2 的表達(dá)下降、BCL2L1 的表達(dá)下降。因此，我們推測(cè)，HK2 在線粒體上的減少，Bax 更容易獲得VDAC-1，VDAC-Bax 復(fù)合物的形成能通過(guò)細(xì)胞色素C 等促凋亡蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。抑制HK2 表達(dá)時(shí)，促進(jìn)Bax 與VDAC 的結(jié)合，細(xì)胞凋亡明顯增加。而腫瘤細(xì)胞中HK2 表達(dá)的調(diào)控是多樣的，與糖酵解途徑中的其他酶一樣，HK2 的表達(dá)主要受c-myc、HIF-1α和p53 的調(diào)控［34］。此外，miR-143、miR-155、miR-218和lincRNA-RoR 等microRNAs 被證明能夠調(diào)節(jié)HK2的表達(dá)［35-38］。SANTAGA 等［39］發(fā)現(xiàn)Roc-A 是HSF1 激活的最強(qiáng)抑制劑。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HK2 的減少伴隨著癌細(xì)胞凋亡的增加，而HK2 的減少對(duì)楝酰胺在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤活性起著關(guān)鍵作用，但楝酰胺影響HK2表達(dá)的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，加入Roc-A 培養(yǎng)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，并且細(xì)胞凋亡與Roc-A 溶液濃度呈正相關(guān)，細(xì)胞HK2、BCL2L1 mRNA 及蛋白表達(dá)均降低。Roc-A可能通過(guò)抑制BCL2L1 mRNA 及蛋白表達(dá)，增加肝癌細(xì)胞的膜通透性，抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。但本研究?jī)HRoc-A 促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探討，詳細(xì)的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。