原核生物基于環(huán)寡核苷酸的抗噬菌體免疫系統(tǒng)研究進展*

吳用宇，張丹丹

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

在微生物學(xué)中探究原核生物對不斷變化的環(huán)境和入侵的外來病原作出反應(yīng)和適應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及分子機制是一個重要研究方向。鑒于適應(yīng)環(huán)境的重要性，原核生物利用多樣的策略來完成這一任務(wù)，其最重要的方式是利用核苷酸衍生的小分子轉(zhuǎn)導(dǎo)外部信號的第二信使信號通路，這些小分子第二信使通過改變轉(zhuǎn)錄、翻譯甚至蛋白活性等發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致細菌的生理行為產(chǎn)生變化[2]。原核中基于環(huán)寡核苷酸的抗噬菌體免疫系統(tǒng)就是一種新發(fā)現(xiàn)的第二信使介導(dǎo)細胞死亡的抗噬菌體系統(tǒng)。

1 原核CBASS的發(fā)現(xiàn)

在細菌與病毒（噬菌體）之間的競賽中，噬菌體不斷更新自己的侵染系統(tǒng)攻破細菌的防線，而細菌為防御噬菌體侵染同樣進化出了一系列的防御系統(tǒng)，如眾所周知的CRISPR-Cas，限制性修飾系統(tǒng)等，研究發(fā)現(xiàn)細菌的抗噬菌體系統(tǒng)都傾向于集中在原核生物基因組的“防御島”[3]，根據(jù)這種與已知防御系統(tǒng)共域化的特性[4]，目前在細菌中發(fā)現(xiàn)了多個新型的抗噬菌體系統(tǒng)，如BREX (Bacteriophage Exclusion)、DISARM(defence island system associated with restriction-modification)等[5,6]。環(huán)二核苷酸（Cyclic dinucleotides），如c-di-GMP和c-di-AMP等是一類存在于真核細胞、細菌和古細菌的第二信使，特別是cyclic GMP-AMP（cGAMP）在真核細胞和細菌中的發(fā)現(xiàn)極大地拓展了我們對于第二信使的認識。真核細胞的cGAMP是由胞內(nèi)的cGAMP合成酶[c-GMPAMP synthase(cGAS)]mammalian合成的，哺乳動物的cGAMP由一個GTP和一個ATP生成，包含一個2’-OH-磷酸二酯鍵。細菌中的cGAMP是利用GTP和ATP在DncV的催化下產(chǎn)生的，細菌的cGAMP卻有2個3’-OH-5’-磷酸二酯鍵，DncV和cGAS都屬于CD-NTase超家族，但是DncV和cGAS一級序列上沒有同源性。

進一步的研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌中編碼DncV的基因同系物也經(jīng)常傾向于出現(xiàn)在防御基因附近[4,5,6]， 并且在霍亂弧菌中DncV合成的cGAMP第二信使激活降解細菌內(nèi)膜的磷脂酶CapV[7,8]，使得細胞膜被降解，膜完整性被破壞從而導(dǎo)致細胞死亡。DncV介導(dǎo)的細胞死亡發(fā)生在噬菌體能夠完成其復(fù)制周期之前，因此感染細胞中不會出現(xiàn)成熟的噬菌體顆粒，從而使噬菌體不會擴散到附近的細胞。這種寡核苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)的抗噬菌體防御方式被命名為CBASS（cyclic oligonucleotide-based anti-phage signaling system）[1]。同時CBASS系統(tǒng)的變體廣泛存在于幾乎所有細菌和古細菌的基因組中，并形成一個巨大且高度多樣化的抗噬菌體防御系統(tǒng)家族。一般而言，CBASS系統(tǒng)至少由兩種蛋白組成，第一種蛋白被認為是作為感知噬菌體的存在，然后產(chǎn)生環(huán)寡核苷酸信號，第二種是效應(yīng)蛋白，作為環(huán)寡核苷酸信號受體，被激活后發(fā)揮細胞殺傷功能。

原核CBASS系統(tǒng)的每個部分都表現(xiàn)出區(qū)別于哺乳動物cGAS通路的多樣性，包括寡核苷酸環(huán)化酶（cGAS/DncV-like nucleotidyltransferase，CD-NTase）及相對應(yīng)的多類第二信使、多種效應(yīng)細胞殺傷因子、輔助調(diào)控因子等。

2 CBASS 系統(tǒng)的組成

2.1 CBASS ?中的CD-NTase及產(chǎn)生的第二信使

CD-NTase 是一種酶，可以合成特定的寡核苷酸信號，放大通路信號和控制下游效應(yīng)反應(yīng)。CD-NTase在動物和細菌信號系統(tǒng)中是保守的，在先天免疫和抗噬菌體防御過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在人類細胞中CD-NTase能夠識別異常出現(xiàn)在胞質(zhì)中的dsDNA并與之結(jié)合從而激活自身環(huán)化酶活性產(chǎn)生2’-5’,3’-5’ cyclic GMP-AMP(2’3’-cGAMP)進而激活下游抗病毒免疫及干擾素信號。在細菌和古菌中，CD-NTase酶在CBASS中同樣作為化學(xué)傳感器發(fā)揮作用，使細菌細胞能夠?qū)κ删w的侵染作出反應(yīng)，并快速啟動信號響應(yīng)[9]。但是與哺乳動物細胞中的CD-NTase需要與dsDNA結(jié)合才能激活的方式不同，細菌中的大多數(shù)CD-NTase在沒有配體的情況下具有催化活性，并在體外就可合成環(huán)核苷酸信號[10]。如在弧菌屬中的DncV是與類葉酸化合物結(jié)合后才受到抑制，包括5-甲基四氫葉酸等核苷酸生物合成所需的代謝物。這表明，細菌中的CD-NTase的調(diào)控可以通過抑制酶活性的配體的結(jié)合來實現(xiàn)，也提示了這些CD-NTase通過感應(yīng)細胞內(nèi)代謝物的消耗或營養(yǎng)饑餓等條件來響應(yīng)噬菌體感染[11]。在活性狀態(tài)下，CD-NTase催化常見的三磷酸核苷酸前體組成環(huán)寡核苷酸信號，并進行多循環(huán)合成。這種迭代過程使得活性狀態(tài)下的CD-NTase能通過相對較少的拷貝產(chǎn)生許多核苷酸第二信使分子，并顯著放大信號響應(yīng)。

CD-NTase 的結(jié)構(gòu)進一步闡釋CD-NTase產(chǎn)生環(huán)寡核苷酸信號的具體分子機制及總體特征。如大腸桿菌RmCdnE與非水解ATP和UTP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)顯示天冬酰胺側(cè)鏈(Asn166)與尿嘧啶堿基形成氫鍵，并將ATPαP定位于UTP的3′-羥基處進行攻擊Asn166位于DncV和cGAS受體核苷酸口袋中絲氨酸殘基的相同位置，并且在CdnE同系物中Asn166幾乎是高度保守的。野生型CdnE合成cUMP-AMP，而當(dāng)將CdnE N166變成S166后該位點幾乎失去利用UTP的活性，但并未失去合成環(huán)寡核苷酸的活性，而是主要合成c-di-AMP。當(dāng)在此位置重新引入原先的天冬酰胺則CdnE回到優(yōu)先生產(chǎn)含嘧啶的產(chǎn)物。這種天冬酰胺取代足以決定CdnE產(chǎn)物的特異性[12]。

幾乎所有CD-NTase都有三個共同的特征：⑴一個共同的DNA聚合酶β樣核苷酸轉(zhuǎn)移酶超家族的蛋白折疊 ；⑵ 通過活性位點的口袋，使用不保守的蛋白支架與更遠的相關(guān)模板聚合酶進行可擴散分子的模板依賴性合成；⑶ 活性位點的結(jié)構(gòu)允許通過活性位點蓋子內(nèi)的氨基酸替換使產(chǎn)物和磷酸二酯連接多樣化。

由于活性位點蓋子延伸的側(cè)鏈中存在高度的氨基酸序列變異性，此變異性為CD-NTase提供識別不同化學(xué)配體和合成具有替代堿基及磷酸二酯連接特異性的不同核苷酸產(chǎn)物所必需的可塑性[13,14]。目前，已知的CD-NTase產(chǎn)物包括二嘌呤、二嘧啶，除環(huán)二核酸外CD-NTase也產(chǎn)生線性寡核苷酸和更大的環(huán)狀核苷酸包括規(guī)范的 3’-5’磷酸二酯和不規(guī)范的2’-5’磷酸二酯連接方式的環(huán)狀三核苷酸。鑒于CD-NTase的多樣性，很可能還有更多類型的第二信使有待發(fā)現(xiàn)。

2.2 四類CBASS操縱構(gòu)型

在CBASS系統(tǒng)中不僅存在大量不同的環(huán)寡核苷酸第二信使，同時還擁有龐大且復(fù)雜的調(diào)控組分，這些不同調(diào)控組分根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的不同，形成四類不同構(gòu)型的調(diào)控系統(tǒng)。在各類不同的構(gòu)型中，雖然許多調(diào)控組分發(fā)揮的具體功能及分子機制仍未知，但是這些不同組分已經(jīng)被證明是組成CBASS系統(tǒng)各類構(gòu)型所必不可少的。

I 型CBASS由一個緊湊的雙基因系統(tǒng)組成。該系統(tǒng)具有僅由CD-NTase基因和效應(yīng)基因組成的最小配置，并無其他相關(guān)輔助基因，這是在原核生物中存在最為廣泛的CBASS構(gòu)型，幾乎可以在所有主要細菌門類中發(fā)現(xiàn)I型CBASS構(gòu)型的存在[1]。大多數(shù)I型CBASS系統(tǒng)中的效應(yīng)因子含有一個或七個跨膜螺旋，預(yù)測一旦被環(huán)寡核苷酸信號激活，就會在膜中形成孔隙[15]。

II 型CBASS在CD-NTase基因和效應(yīng)基因組成的基礎(chǔ)上還包括兩個編碼真核經(jīng)典泛素化相關(guān)結(jié)構(gòu)域的基因，其中，兩個輔助因子被稱為cap2和cap3[16]。cap2中包括真核經(jīng)典泛素激活的E1酶結(jié)構(gòu)域和泛素結(jié)合的E2酶結(jié)構(gòu)域，而cap3僅編碼一個蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常發(fā)現(xiàn)于真核生物去泛素化酶中，且被預(yù)測為是JAB/JAMM家族的異肽酶，該酶可將泛素從靶蛋白中去除。由于cap3的基因較短，在少數(shù)II型CBASS系統(tǒng)中存在cap2和cap3的基因融合或cap3的基因與效應(yīng)基因融合的情況。同時，有小部分II型CBASS系統(tǒng)具有更小的構(gòu)型，即除環(huán)化酶及效應(yīng)子對外，僅包括一個短的E2結(jié)構(gòu)域的基因，不包括E1或JAB。

十分有趣的是，cap2和cap3是抵御部分但不是所有噬菌體所必需的，表明這些基因在CBASS系統(tǒng)中具有輔助功能，擴大系統(tǒng)抵御噬菌體的范圍。但是，對于cap2和cap3的靶向分子機制并未被闡釋清楚，目前也尚缺乏哪種蛋白是cap2和cap3輔助編碼的泛素處理結(jié)構(gòu)域靶標(biāo)的證..據(jù)，同時，對于僅包含E2結(jié)構(gòu)域基因的亞型，尚不清楚其是單獨發(fā)揮作用，還是利用細胞中的其他基因來填補缺失的E1和JAB結(jié)構(gòu)域功能。在II型CBASS系統(tǒng)中最常見的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是一種磷脂酶結(jié)構(gòu)域，這種磷脂酶一旦被信號分子激活就會降解細菌內(nèi)膜。

III 型CBASS在寡核苷酸環(huán)化酶和效應(yīng)基因組成的基礎(chǔ)上還包括編碼HORMA和TRIP13結(jié)構(gòu)域的基因，這些輔助編碼的結(jié)構(gòu)域迄今為止也都是主要在真核生物中被發(fā)現(xiàn)的[17]。其中一個因子cap7是具有HORMA結(jié)構(gòu)域的蛋白，這類蛋白形成信號復(fù)合物控制真核生物減數(shù)分裂、有絲分裂和DNA的修復(fù)[18]；第二個因子cap6具有TRIP13結(jié)構(gòu)域（也稱為Pch2結(jié)構(gòu)域），這是一種已知的HORMA結(jié)構(gòu)域蛋白活性抑制劑[19]。在真核生物中，TRIP13蛋白解離HORMA信號復(fù)合物，使得信號關(guān)閉。

在III型CBASS中HORMA結(jié)構(gòu)域蛋白(Cap7)對于噬菌體防御至關(guān)重要，并且寡核苷酸環(huán)化酶只有在與HORMA結(jié)構(gòu)域蛋白（Cap7）物理結(jié)合時才會變得有活性。相比之下，TRIP13結(jié)構(gòu)域蛋白Cap6發(fā)揮著從寡核苷酸環(huán)化酶中解離HORMA結(jié)構(gòu)域蛋白的作用，表明TRIP13是環(huán)寡核苷酸產(chǎn)生的負調(diào)控因子。在正常條件下，Cap6阻止Cap7與寡核苷酸環(huán)化酶結(jié)合；然而在噬菌體感染期間，Cap7識別感染（可能通過與噬菌體編碼蛋白結(jié)合）并改變構(gòu)象從而與寡核苷酸環(huán)化酶結(jié)合。這種結(jié)合激活環(huán)狀寡核苷酸分子的產(chǎn)生，進而激活效應(yīng)蛋白導(dǎo)致細胞死亡，使噬菌體無法完成其復(fù)制周期[20,21]。而III型CBASS在變形菌門中被過度表達，在厚壁菌門中卻幾乎不存在，在III型CBASS中除了一種具有單一的HORMA結(jié)構(gòu)域蛋白（cap7）外，還存在另外一種HORMA結(jié)構(gòu)域的蛋白。僅通過基于結(jié)構(gòu)的比較而不是基于序列的比較，其中的一種蛋白Cap8與正常HORMA結(jié)構(gòu)域相比存在相當(dāng)大的差異，這種不同的Cap8的HORMA結(jié)構(gòu)域在體外不能激活環(huán)化酶，猜測其可能作為腳手架的方式發(fā)揮作用。

IV 型CBASS在寡核苷酸環(huán)化酶基因和效應(yīng)基因組成的基礎(chǔ)上還包括具有核苷酸修飾結(jié)構(gòu)域的輔助蛋白基因，通常IV型CBASS中的輔助因子由cap9和cap10組成，這兩個蛋白是具有參與核苷酸修飾的結(jié)構(gòu)域。cap9具有一個預(yù)測的QueC酶結(jié)構(gòu)域，已知該結(jié)構(gòu)域可將修飾的堿基7-羧基-7-脫氮鳥嘌呤（CDG）轉(zhuǎn)化為7-氰基-7-脫氮鳥嘌呤（preQ0）[22,23]。cap10被預(yù)測是一種TGT酶，這類酶催化tRNA分子中特定的鳥嘌呤殘基與preQ0的堿基交換[24]，且可以修飾DNA上的鳥嘌呤殘基[25]。

在IV型CBASS系統(tǒng)中也存在另一個被注釋為N-糖基化酶/DNA裂解酶（OGG）的基因（cap11）。根據(jù)目前已知N-糖基化酶/DNA裂解酶可去除DNA中受損的鳥嘌呤堿基（8-oxoG），并在脫嘌呤/脫嘧啶位點使DNA產(chǎn)生缺口[26]。迄今為止，還沒有IV型CBASS系統(tǒng)通過證實能防御噬菌體，其輔助基因的確切功能仍不清楚，且IV型CBASS系統(tǒng)較集中存在于古細菌中。

CBASS 系統(tǒng)中的這四類輔助操縱構(gòu)型復(fù)雜且精密，而且其中許多組分結(jié)構(gòu)域在之前是僅在真核細胞中發(fā)現(xiàn)的，同時還有許多的猜想和問題需要被驗證和解釋。這些調(diào)控組分可能作用于CBASS系統(tǒng)中的各個不同的階段以達調(diào)控該系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，最終則由效應(yīng)殺傷因子負責(zé)整個系統(tǒng)表觀功能上的表達。

2.3 CBASS 中的效應(yīng)殺傷因子

CBASS 系統(tǒng)中的多類效應(yīng)殺傷因子作為整個系統(tǒng)中的最終效應(yīng)因子，通過各類殺傷手段使細胞出現(xiàn)提前死亡的現(xiàn)象，其效應(yīng)蛋白通常由兩個結(jié)構(gòu)域組成，包括環(huán)寡核苷酸感應(yīng)結(jié)構(gòu)域和細胞殺傷結(jié)構(gòu)域。通過目前已知的結(jié)構(gòu)及序列分析，CBASS中的效應(yīng)殺傷因子包括一個以前未被表征過的SAVED結(jié)構(gòu)域和各類型的殺傷結(jié)構(gòu)域，其中新發(fā)現(xiàn)的SAVED結(jié)構(gòu)域負責(zé)識別環(huán)寡核苷酸信號。以cap4為例，從結(jié)構(gòu)上看C-末端SAVED結(jié)構(gòu)域與CRISPR相關(guān)的CARF結(jié)構(gòu)域蛋白有明確結(jié)構(gòu)同源性，由兩個單獨的CARF樣亞基形成偽對稱的形式存在，這樣的偽對稱形態(tài)使SAVED結(jié)構(gòu)域的單鏈結(jié)構(gòu)允許識別不同的不對稱核苷酸識別信號。N端結(jié)構(gòu)域則是廣泛存在于細菌中的未表征蛋白結(jié)構(gòu)域4297(DUF4297)的成員，且該DUF4297結(jié)構(gòu)域與II型限制性內(nèi)切酶具有結(jié)構(gòu)同源性，包括AgeI和HindIII酶等，發(fā)揮著降解dsDNA的殺傷作用。

影像融合首先用QuickBird多光譜影像和全色影像進行幾何配準；然后分別采用彩色合成變換［4］、IHS 變換、K-L 變換［5,6］和 Brovey 變換［7］進行融合處理；最后通過統(tǒng)計平均值、標(biāo)準差、偏差指數(shù)、信息熵和相關(guān)系數(shù)，比較不同方法［8］的融合效果。

效應(yīng)殺傷結(jié)構(gòu)域除了該類核酸內(nèi)切酶外還包括能降解內(nèi)細胞膜磷脂的patatin-like磷脂酶結(jié)構(gòu)域、能夠造成細胞膜穿孔的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域、能降解蛋白的肽酶結(jié)構(gòu)域、與Thoeris抗噬菌體系統(tǒng)相關(guān)的TiR結(jié)構(gòu)域及少數(shù)的磷酸化酶/核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域。

CBASS 效應(yīng)殺傷因子依靠這兩個結(jié)構(gòu)域分兩步發(fā)揮作用。其中環(huán)寡核苷酸感應(yīng)結(jié)構(gòu)域一旦感知到環(huán)寡核苷酸就會被激活，隨后使各類細胞殺傷結(jié)構(gòu)域作用于相應(yīng)靶標(biāo)，對細胞產(chǎn)生殺傷作用，從而使細胞死亡。各類不同的殺傷結(jié)構(gòu)域根據(jù)其不同的特性發(fā)揮其特有的功能對細胞產(chǎn)生殺傷作用。

3 總結(jié)與展望

cGAS 途徑是首先發(fā)現(xiàn)于真核生物中的一個至關(guān)重要的抗病毒免疫通路。而細菌中的CBASS系統(tǒng)是在原核生物中被發(fā)現(xiàn)并揭示的一種CD-NTase介導(dǎo)的全新的抗病毒（噬菌體）機制，根據(jù)目前的研究，CBASS系統(tǒng)由三大部分構(gòu)成，分別是寡核苷酸環(huán)化酶（CD-NTase）、四類型操縱子及各類不同的下游殺傷性效應(yīng)因子。

噬菌體感染細胞的某些信號使得寡核苷酸環(huán)化酶（CD-NTase）激活產(chǎn)生第二信使將信號傳遞下去，同時在CBASS中四種不同構(gòu)型的操縱子也對該系統(tǒng)的運作及調(diào)控發(fā)揮重大作用。在CD-NTase產(chǎn)生不同類型的環(huán)寡核苷酸第二信使后，這些環(huán)寡核苷酸信使被相應(yīng)效應(yīng)殺傷因子的SAVED結(jié)構(gòu)域所識別，之后便會激活相應(yīng)各類不同的殺傷結(jié)構(gòu)域通過各種不同的殺傷方式使細胞提前死亡，以此來阻止噬菌體的成熟，從而達到抗噬菌體的目的。

原核CBASS系統(tǒng)的揭示為之前僅在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的cGAS-STING抗病毒途徑拓展了一個全新的研究大方向，并且已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明，原核CBASS系統(tǒng)與cGAS-STING通路存在進化上的關(guān)聯(lián)，哺乳動物cGAS-STING通路極有可能是原核CBASS系統(tǒng)演變進化形成的。但是，目前這個新型的抗噬菌體防御系統(tǒng)仍有許多未知的謎題等待被發(fā)掘和解釋，如CBASS系統(tǒng)中的CD-NTase到底是如何感應(yīng)噬菌體的入侵從而轉(zhuǎn)化為激活態(tài)，因為原核細胞胞質(zhì)中游離著自身的dsDNA，其大概率不同于哺乳動物cGAS通路那般通過識別胞質(zhì)dsDNA來實現(xiàn)激活，且大多數(shù)CD-NTase在體外沒有其他配體的情況下具有催化活性，其在細胞內(nèi)的激活與否必然依靠著其他不同的方式，但這仍需大量的研究來揭示和證明。

四類型豐富且復(fù)雜的調(diào)控模塊的研究及闡釋則仍處于相對空白的階段，這些發(fā)現(xiàn)在真核生物中的結(jié)構(gòu)域在原核生物中又具體發(fā)揮什么樣的作用，如此多樣且復(fù)雜的操縱模塊究竟是如何作用于CBASS的調(diào)控等這些問題也仍需要大量的分析和深入的研究來解答。作為CBASS中最終的效應(yīng)殺傷因子同時也有著多樣的殺傷結(jié)構(gòu)域，其不同的殺傷分子機制也仍待揭示。對CBASS系統(tǒng)的深入研究不僅是對原核中這種新型抗噬菌體系統(tǒng)的揭示與探究，由于其與哺乳動物cGAS-STING通路在進化上的緊密關(guān)聯(lián)，使其更可能有著與哺乳動物cGAS-STING通路相關(guān)研究互相照應(yīng)、互相提示的重大意義。