雷公藤甲素致生殖細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

李昕融，楊大航，黃鳳嬌，朱文全，黃愉淋*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣西 南寧 530200）

雷公藤甲素（triptolide，TP）又被稱為雷公藤內(nèi)酯醇，它是從雷公藤（tripterygium wilfordii Hook.f.）中提取鑒定出來的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物。雷公藤在中醫(yī)藥的運用具有悠久歷史，TP 在雷公藤內(nèi)含量較高，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗炎、抗腫瘤等功能，對多種癌癥如乳腺癌、胰腺癌及肺癌等均有良好的抑癌作用［1］。然而，因為TP 對機體生殖系統(tǒng)具有毒副作用，如可抑制雄性生物生精細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞的生長發(fā)育，從而導(dǎo)致雄性生殖能力下降甚至不育；對于雌性生物，TP 可促進(jìn)卵泡閉鎖及卵母細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致雌性生殖能力下降，因此，TP在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制。本文就雷公藤甲素致生殖細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展綜述如下。

1 對雄性生殖細(xì)胞的影響

大量臨床試驗表明TP藥理活性較強且毒性較大，可以導(dǎo)致細(xì)胞突變，還可使雄性生育能力降低。主要通過促使睪丸萎縮、降低睪丸的臟器系數(shù)這兩種方式減少各級生精細(xì)胞和精子數(shù)量，并促使這兩類細(xì)胞變性、壞死，該藥物還可以通過毒性蓄積產(chǎn)生抗生育作用［2］。

1.1 對生精細(xì)胞的影響 睪丸生精細(xì)胞主要包括精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，生精細(xì)胞跟精子發(fā)生的聯(lián)系最密切，各級生精細(xì)胞的死亡可以使男性精子數(shù)量減少、精子活力降低甚至不育［3］。TP不僅能抑制生精細(xì)胞的增殖［4］，而且所導(dǎo)致的睪丸生精細(xì)胞損傷具有細(xì)胞選擇性［5］。李博懌研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可以通過使SCF（干細(xì)胞因子）、c-kit（干細(xì)胞生長因子受體）表達(dá)增加來促進(jìn)精母細(xì)胞的凋亡［6］。吳建元等［7］研究結(jié)果顯示，長期服用雷公藤多苷片可能促使核轉(zhuǎn)錄因子NFκB 表達(dá)過度抑制，使睪丸精母相關(guān)凋亡基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。邱魯陽等［8］對小鼠進(jìn)行雷公藤多苷灌胃后，發(fā)現(xiàn)Piwil2、Stat3 及Bcl-2 蛋白在雄性小鼠睪丸組織生精細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著降低，小鼠表現(xiàn)為不育。且三種蛋白在生精小管（包括生精細(xì)胞）及間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置存在相關(guān)性。Piwil2、Stat3及Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)量顯著降低，說明雷公藤多苷可促進(jìn)小鼠的雄性生殖細(xì)胞凋亡。修曉宇等［9］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)線期初級精母細(xì)胞可能對雷公藤甲素反應(yīng)最為敏感。WANG 等［10］研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可促使體內(nèi)培養(yǎng)或體外培養(yǎng)環(huán)境中的活性氧簇（ROS）水平提高，并以此破壞睪丸支持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡從而激活JNK 通路，使精母細(xì)胞凋亡。ZHANG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以通過抑制SC 中依賴 Sp1 的 PFKP 表達(dá)，從而抑制 GATA4 介質(zhì)糖解，并產(chǎn)生睪丸毒性，使精母細(xì)胞凋亡。

1.2 對睪丸支持細(xì)胞的影響 睪丸的精曲小管由支持細(xì)胞和生精細(xì)胞共同構(gòu)成，支持細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上為生精細(xì)胞的分化和成熟提供了支架的作用，供給其生精過程所需的能量和相關(guān)的一系列營養(yǎng)物質(zhì)，同時可分泌調(diào)節(jié)蛋白類、轉(zhuǎn)運蛋白類、生長因子類、類固醇類等十多種物質(zhì)參與生精細(xì)胞的分化和成熟，具有精細(xì)的協(xié)調(diào)作用，可使精子發(fā)生的環(huán)節(jié)正常有序進(jìn)行［12］。雷公藤甲素可使小鼠睪丸支持細(xì)胞氧化應(yīng)激水平上調(diào)，使Akt和p70S6K 激活，可能通過此種方式促進(jìn)生殖細(xì)胞凋亡［13］。雷公藤多苷具有抑制睪丸支持細(xì)胞G1期及S 期分裂的作用，從而可影響雄激素結(jié)合蛋白的分泌并抑制生精細(xì)胞的發(fā)生，促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡［14］。雷公藤多苷引起的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變會使性激素分泌水平發(fā)生改變，從而影響生精細(xì)胞的凋亡率［15］。除此之外，雷公藤多苷可以促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞Fas 促凋亡基因的表達(dá)［16］，可能調(diào)控支持細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，促進(jìn)生殖細(xì)胞的凋亡［17］。

1.3 對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響 葉小云等［18］用不同濃度（50、100、200 nmol/L）的TP 處理TM3 細(xì)胞（小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞），對照組采用0.1%濃度DMSO（二甲基亞砜）的等體積無血清培養(yǎng)液，在經(jīng)過37 ℃恒溫孵育箱培養(yǎng)24 h 后，發(fā)現(xiàn)對照組LDH 的活性隨TP 濃度升高顯著增強，TP 各濃度組凋亡率與對照組比較均上調(diào)，其中200 nmol/L 組與對照組比較差異顯著（P＜0.05），另外，與對照組相比，pAMPK/AMPK 比值明顯降低，p-Akt/Akt 比值和p-mTOR 磷酸化水平均升高。由此可知雷公藤甲素可以通過影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞活性，使AMPK 抑制和Akt/mTOR 通路活化，通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

2 對雌性生殖細(xì)胞的影響

2.1 雷公藤甲素對卵巢及卵母細(xì)胞毒性的作用 卵巢是雌性動物的生殖器官，卵母細(xì)胞由卵巢產(chǎn)生，卵母細(xì)胞發(fā)育及成熟情況對雌性生殖具有重要影響。阮秦莉等［19］將年輕成蟲期秀麗隱桿線蟲隨機分為空白組、雷公藤甲素組及補腎活血湯組（62.5、125、250 mg/ml），雷公藤甲素構(gòu)建秀麗隱桿線蟲卵巢儲備功能下降模型，補腎活血湯分別處理24、48和72 h后，統(tǒng)計后代的數(shù)目、子宮內(nèi)受精卵的數(shù)目、未受精卵母細(xì)胞的數(shù)目、有絲分裂區(qū)的細(xì)胞數(shù)目、凋亡細(xì)胞以及卵母細(xì)胞數(shù)目，采用RT-PCR 測定細(xì)胞凋亡通路相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲ced-3 基因表達(dá)水平升高并降低ced-9 基因表達(dá)水平，從而提高卵母細(xì)胞的凋亡率。劉宴娟等［20］研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素導(dǎo)致的ERK/c-fos 異常表達(dá)可能會促進(jìn)倉鼠卵巢細(xì)胞凋亡。

2.2 雷公藤甲素對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響 隨著生殖細(xì)胞凋亡研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動物的卵泡閉鎖實際上是GCs（卵巢顆粒細(xì)胞）凋亡的結(jié)果，而卵泡閉鎖可以導(dǎo)致生殖功能的衰退［21］。TP 可以促進(jìn)GCs 的凋亡，并且用藥劑量和藥物效應(yīng)的相關(guān)度較高［22］。曾又佳等［23］研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可能通過提高卵泡顆粒細(xì)胞的線粒體凋亡蛋白Cyt C、APAF-1表達(dá)和降低XIAP 抗凋亡蛋白的表達(dá)來促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。研究顯示，雷公藤甲素在質(zhì)量濃度為30 μg/L時GCs凋亡率出現(xiàn)了明顯上升的情況，質(zhì)量濃度在100 μg/L及200 μg/L時GCs凋亡率反而有下降趨勢，此種現(xiàn)象可能與GCs 的自我保護(hù)機制有關(guān)，且雷酚內(nèi)酯在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著雷酚內(nèi)酯質(zhì)量濃度不斷增高，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率也隨之不斷升高，這些主要的雷公藤單體對細(xì)胞凋亡的影響沒有呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間的相關(guān)效應(yīng)，而是表現(xiàn)出一種復(fù)雜的變化現(xiàn)象［24］。徐麗萍等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在同等劑量下，雷公藤多苷間歇給藥方案對生殖功能損害作用更輕微，對雌性卵泡生殖細(xì)胞的促凋亡作用也更小。研究表明［26］，雷公藤多苷（TG）能夠通過誘導(dǎo)內(nèi)源性miR-15a 表達(dá)并抑制Hippo-YAP/TAZ 途徑，對卵巢顆粒細(xì)胞具有毒性作用，會促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡。

2.3 雷公藤甲素對卵泡細(xì)胞的影響 卵泡是卵巢的基本功能單位。卵泡具有的特殊微環(huán)境，可以保護(hù)卵母細(xì)胞，直到卵母細(xì)胞被選擇而開始生長和發(fā)生排卵［27］。郜然然［28］研究認(rèn)為，雷公藤甲素可能通過下調(diào)PI3K、AKT、mTOR 信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 在細(xì)胞膜表面的表達(dá)含量而對該類通路進(jìn)行抑制，用一定濃度的雷公藤甲素對大鼠進(jìn)行給藥，通過此機理可以構(gòu)建大鼠卵泡發(fā)育障礙的體內(nèi)動物模型。而馬蔚蓉等［29］研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素不僅僅可能通過下調(diào)PI3K、AKT、mTOR信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 在細(xì)胞膜表面的表達(dá)含量來抑制卵泡細(xì)胞的發(fā)育，還有可能通過抑制Nrf-2/HO-1抗氧化應(yīng)激途徑來促進(jìn)卵泡細(xì)胞的早衰，從而使卵泡細(xì)胞儲備數(shù)量降低。林慧文等［30］實驗研究發(fā)現(xiàn)，用雷公藤多苷片依照50 mg/kg 的給藥比例每天對大鼠進(jìn)行灌胃1次，進(jìn)行14 d造模，造模停止15 d后大鼠狀態(tài)逐漸趨向正常水平，但體內(nèi)多種激素水平和卵泡細(xì)胞的凋亡率仍然保留在造模后水平，35 d 后仍未恢復(fù)正常。還可觀察到用雷公藤多苷灌胃的雌性小鼠出現(xiàn)卵巢早衰的癥狀，同時卵巢早衰的大鼠表達(dá)SCF 蛋白水平有一定增高，TGF-βRⅡ、Cx-37 蛋白的表達(dá)量減少，說明雷公藤多苷可能通過影響以上幾種蛋白的表達(dá)來促進(jìn)卵泡細(xì)胞的凋亡［31］。陳燕霞等［32］研究表明，雷公藤多苷可以降低子宮和卵巢指數(shù)，升高FSH、LH 水平，降低E2水平，減少生長卵泡以及黃體數(shù)量并增加閉鎖卵泡的數(shù)量。除此之外，雷公藤多苷還可能抑制VEGF 及其受體flt-l、kdr 蛋白的表達(dá)，以此來促進(jìn)卵泡細(xì)胞的凋亡［33］。還有實驗表明，雷公藤多苷可以使血清FSH、LH水平明顯提高，使E2、AMH及INHB水平明顯降低［34］。

3 前景與展望

綜上所述，TP主要通過細(xì)胞凋亡活動對生殖細(xì)胞產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致精子或卵子產(chǎn)生過程紊亂，從而引起生殖毒性。當(dāng)前研究主要集中于觀察TP 引起生殖細(xì)胞某些基因或蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變，僅僅從某一方面來研究TP生殖毒理作用，缺乏從整體的角度對其進(jìn)行深入探討，因而不能全面地說明其生殖毒性的作用靶點及調(diào)控分子機制。因此，在未來，我們希望可以通過蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)地對TP 作用前后生殖細(xì)胞進(jìn)行分析，力求較全面揭示TP的生殖毒性作用機理，為其臨床合理應(yīng)用及其增效減毒衍生物的研發(fā)提供實驗依據(jù)和理論支撐。