阿魏酸對人臍帶血內(nèi)皮祖細胞生物學功能及血小板衍生生長因子分泌能力的影響

胡婧蓉，陳姿霖，朱芙蓉，白雪，張熙，趙卓陽，何晶晶，熊武

1湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科，長沙410007；2湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院；3湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；4湖南中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院病理學教研室；5湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院

內(nèi)皮祖細胞(EPCs)大多位于骨髓中，少數(shù)可以在外周血中發(fā)現(xiàn)，能夠分化成為血管內(nèi)皮細胞。內(nèi)皮細胞可以通過遷移和增殖，從原先已有的血管以發(fā)芽的形式形成新的血管[1]。研究表明，EPCs的數(shù)量、功能及其活性與血管新生密切相關(guān)。血小板衍生生長因子(PDGF)是EPCs分泌的生長因子之一，能夠刺激肉芽組織生成、促進血管新生、加快創(chuàng)面愈合及修復(fù)[2]。在血管新生功能不良及傷口不易愈合的糖尿病血管并發(fā)癥中，EPCs對潰瘍治療和創(chuàng)面愈合有重要作用[3]。通過促進EPCs數(shù)量增加，改善其功能及活性，可以加強EPCs的血管新生作用，治療糖尿病血管并發(fā)癥引發(fā)的潰瘍。阿魏酸(FA)是阿魏、當歸、川芎等具有活血化瘀功效的中草藥的主要活性成分，具有抑制血小板聚集、改善組織局部血供和促進血管新生的作用[4]。2020年9月—12月，我們將FA體外作用于EPCs，觀察其對EPCs增殖、黏附、遷移和成管等生物學功能以及分泌PDGF的影響，旨在為FA調(diào)節(jié)EPCs介導(dǎo)的血管新生研究奠定基礎(chǔ)，進一步為FA用于臨床治療糖尿病足潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 無菌條件下取足月健康新生兒中的臍帶血。本研究獲得湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核同意，臍帶血的獲取得到孕婦及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.1.2 藥物與試劑 FA(中國北京索萊寶科技有限公司)，青霉素—鏈霉素雙抗溶液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，胰酶(美國GIBCO公司)，PBS緩沖液(美國Hyclone公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國GIBCO公司)，淋巴細胞分離液(美國Solarbio公司)，纖維連接蛋白(美國Sigma公司)，F(xiàn)ITC標記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-1，美國Sigma公司)，DAPI(美國Sigma公司)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(美國Thermo Fisher Scientific公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)，PDGF ELISA檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器 臺式低速離心機(上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司)，4 ℃離心機(德國Eppendorf公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，倒置生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，熒光顯微鏡(北京同舟同德公司)，Thermo熱電MK3酶標儀(美國BD Pharmingen公司)。

1.2 EPCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 將臍帶血抗凝靜置后，加入淋巴細胞分離液，1 500 r/min離心30 min，獲得單個核細胞。將單個核細胞加入PBS緩沖液，1 000 r/min離心5 min，此過程重復(fù)2遍。加入含5%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。取貼壁細胞，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。連續(xù)培養(yǎng)7 d后，用胰酶消化貼壁細胞進行傳代。經(jīng)CD31抗體和DAPI核染、FITC-UEA-1和Dil-AC-LDL雙熒光聯(lián)合染色法鑒定得到EPCs。

1.3 FA促EPCs增殖最佳濃度的篩選 將獲得的EPCs分別加入0、1、2、4、8、16 mg/L FA，培養(yǎng)48 h。采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示，0、1、2、4、8、16 mg/L FA作用后的細胞增殖OD值分別為0.50±0.04、0.71±0.02、0.78±0.08、0.90±0.04、0.92±0.07、0.92±0.03。以FA濃度為8 mg/L時細胞增殖能力最強，故將此濃度作為FA促EPCs增殖的最佳濃度。

1.4 EPCs增殖能力觀察 收集對數(shù)生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，配制成100 μL的細胞懸液，按每孔1×105個細胞接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細胞分成FA組和對照組，F(xiàn)A組加入8 mg/L FA，對照組加入等體積PBS，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按每孔10 μL加入CCK-8溶液，孵育4 h。上酶標儀，于450 nm處測定光密度(OD)值，以O(shè)D值表示細胞增殖能力。

1.5 EPCs黏附能力觀察 采用細胞黏附試驗。收集對數(shù)生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，配制成500 μL的細胞懸液，按每孔1×105個細胞接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細胞分為FA組和對照組，分別加入8 mg/L FA和等體積PBS，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在包被有大鼠纖維連接蛋白的培養(yǎng)板上接種EPCs，37 ℃培養(yǎng)30 min。在倒置生物顯微鏡(200×)下計數(shù)貼壁細胞數(shù)目。

1.6 EPCs遷移能力觀察 采用細胞劃痕試驗。用滅菌的Marker筆于6孔板背面劃5條以上間隔1 cm橫穿過孔的線。取對數(shù)生長期細胞，按每孔5×105個細胞接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天用無菌200 μL槍頭在培養(yǎng)孔底部中央劃線，與背后的橫線劃痕相垂直，用PBS洗掉劃下的細胞。將細胞分為兩組，F(xiàn)A組加入8 mg/L FA，對照組加入等體積PBS，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在倒置生物顯微鏡(200×)下，利用顯微標尺取不同的2個視野，在0、48 h分別測量劃痕愈合狀況，計算細胞遷移絕對寬度，以此表示細胞遷移能力。細胞遷移絕對寬度=0 h劃痕的平均邊距-48 h劃痕的平均邊距。

1.7 EPCs成管能力觀察 采用Matrigel體外成管試驗。用M200無血清及生長因子補充物的培養(yǎng)基1∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠，均勻混勻后，按每孔50 μL加入提前預(yù)冷的12孔板中，37 ℃孵育30 min。當細胞生長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按每孔1×105個細胞接種于12孔板，每孔加入1 mL含10% FBS的DMEM/F12重懸，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，F(xiàn)A組加入8 mg/L FA，對照組加入等體積PBS，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在生物倒置顯微鏡下拍照觀察，計數(shù)小管形成數(shù)量，取平均值。

1.8 EPCs分泌PDGF水平檢測 采用ELISA法。收集對數(shù)生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，配制成100 μL的細胞懸液，按每孔1×105個細胞接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細胞分為兩組，F(xiàn)A組加入8 mg/L FA，對照組加入等體積PBS，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。分別取兩組細胞上清液，嚴格按照PDGF ELISA檢測試劑盒說明，上酶標儀測量450 nm處的OD值，計算PDGF含量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 FA組OD值為0.77±0.13，對照組為0.43±0.07，F(xiàn)A組OD值高于對照組(P<0.01)。

2.2 兩組細胞黏附能力比較 FA組貼壁細胞數(shù)為(48.66±5.82)個，對照組為(31.32±2.90)個，F(xiàn)A組貼壁細胞數(shù)較對照組增加(P<0.01)。

2.3 兩組細胞遷移能力比較 FA組細胞遷移絕對寬度為(13.13±0.25)mm，對照組為(10.77±0.76)mm，F(xiàn)A組細胞遷移絕對寬度較對照組增加(P<0.01)。

2.4 兩組細胞成管能力比較 FA組體外成管數(shù)為(594.91±73.12)個，對照組為(271.64±31.02)個，F(xiàn)A組體外成管數(shù)高于對照組(P<0.01)。

2.5 兩組PDGF水平比較 FA組PDGF水平為(249.97±14.23)pg/mL，對照組為(53.97±9.62)pg/mL，F(xiàn)A組PDGF水平高于對照組(P<0.01)。

3 討論

FA又稱4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，存在于阿魏、當歸和川芎等多種中藥中，是桂皮酸(肉桂酸)的衍生物，有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)。FA具有改善血液循環(huán)、促進血管生成、加速傷口愈合、抗氧化[5]、抗血栓[6]、降血脂、降低心肌缺血和耗氧量、抗菌[7]、抗病毒、抗癌等多種功效。BAIRAGI等[8]報道，在糖尿病大鼠創(chuàng)面中，用FA負載聚合物納米粒子分散(口服)和FA負載聚合物納米粒子(局部給藥)治療后，創(chuàng)面上皮化速度快，對創(chuàng)面愈合有明顯的促進作用。在創(chuàng)面愈合過程中，血管新生具有關(guān)鍵作用，而內(nèi)皮細胞增生是血管新生的開始。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A能通過調(diào)節(jié)JAK-STAT通路促進血管內(nèi)皮細胞增殖，從而促進血管新生，改善缺氧所造成的細胞形態(tài)改變[9]。SHAO等[10]報道，F(xiàn)A可通過血栓調(diào)節(jié)素通路顯著緩解人臍靜脈內(nèi)皮細胞受到的輻射損傷，減輕4 Gy劑量輻射對內(nèi)皮細胞增殖能力、細胞活力、管形成能力、細胞周期和炎癥反應(yīng)的影響。然而FA是否存在新的促血管新生途徑，目前尚無文獻報道。

EPCs的動員、招募和分化在促進血管新生、血管重構(gòu)和早期抗炎過程中發(fā)揮重要作用。EPCs在上述過程中通過直接和間接兩種途徑發(fā)揮作用，直接途徑為EPCs直接形成血管；間接途徑依賴于EPCs分化成血管內(nèi)皮細胞及其分泌的有關(guān)因子參與血管新生[11]，雖然經(jīng)內(nèi)皮祖細胞分化的內(nèi)皮細胞不是構(gòu)建體外血管化組織的標準內(nèi)皮細胞[12]，但在血管新生過程中也有重要價值。在治療缺血性疾病如缺血性心臟病和跛行方面，增加內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量和改善其功能已經(jīng)成為治療方法之一[13-14]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)A組細胞增殖能力高于對照組，表明FA能夠明顯加快EPCs增殖，促進毛細血管內(nèi)皮細胞的再生；FA組貼壁細胞數(shù)較對照組增加，表明FA能夠增強EPCs的黏附能力，使EPCs更好地黏附聚集于受損的血管組織，促進內(nèi)皮修復(fù)；FA組細胞遷移絕對寬度較對照組增加，表明FA能夠增強EPCs的遷移能力，促使其歸巢于受損組織，加速缺血組織或創(chuàng)面的愈合；FA組體外成管數(shù)高于對照組，表明FA能夠增強EPCs的成管能力，增加血管新生。FA通過促進EPCs的增殖、黏附、遷移及體外成管能力，促使局部組織再內(nèi)皮化，增強血管形成能力，促進血管新生，具有促進創(chuàng)面愈合的潛能。

PDGF與血管內(nèi)皮生長因子具有同源性，其在內(nèi)皮細胞中高度表達，是促進血管生成的重要因子之一[15]。PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是細胞纖維化過程中的中樞介質(zhì)[16]，成纖維細胞的數(shù)量隨PDGF的增加而增加，大量成纖維細胞有助于膠原蛋白的合成[17]，能夠促進血管新生。研究顯示，PDGF家族中的PDGF-C和PDGF-D是治療許多眼部新生血管疾病如增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變等重要靶分子[18]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)A組PDGF水平高于對照組，表明FA能夠促進EPCs分泌PDGF，從而促進血管新生。

綜上所述，F(xiàn)A能夠在體外增強EPCs的生物學功能，并促進細胞分泌PDGF，具有加強EPCs介導(dǎo)的血管新生從而促進創(chuàng)面愈合的潛能。這表明FA對血管新生的促進作用不僅在于能正向調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的生物學功能，還能直接作用于EPCs，從根源上調(diào)控血管再內(nèi)皮化進程，為后續(xù)深入研究FA通過EPCs介導(dǎo)的血管新生促進創(chuàng)面愈合的機制研究奠定了理論基礎(chǔ)。