腎纖維化手術動物模型構建及相關機制研究進展*

劉 洋 張瑞紅 只素娟 劉蘭蘭 劉旭玥 馮曉寧 張曉麗

（山東大學齊魯醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學與組織學胚胎學教研室，濟南 250012）

慢性腎臟疾病在中國較常見的是IgA腎病[1]，其次為糖尿病腎病、高血壓腎病及其他，它們的終末階段主要表現(xiàn)為腎纖維化[2-4]。腎纖維化的病理改變主要為腎小球硬化，腎間質(zhì)中大量膠原纖維形成等[5]。目前，我國患有慢性腎病的人數(shù)逐年增加[6]，臨床上治療慢性腎病發(fā)展為腎纖維化過程方面仍然十分困難[7]。在研究腎纖維化發(fā)生機制中，由于臨床標本難以獲得，因此建立動物模型可以更方便地進行相關實驗研究。目前常用的構建模型的方法包括手術建模、藥物或毒物誘導模型、復合模型和轉基因模型，其中，藥物或毒物建模的劑量和時間不易控制，復合模型過程比較繁瑣，轉基因模型花費高昂且其應用范圍較窄，而手術建模的方法簡便、快捷、應用廣，而且能更好地模擬人類腎纖維化的進程[8]。因此，本文主要對腎纖維化手術建模方法以及機制研究進行總結。

1 腎纖維化手術建模類型

腎纖維化手術建模主要包括3種類型：腎組織大部切除術、缺血再灌注損傷和單側輸尿管結扎。腎組織大部切除術建模的原理主要是通過將腎組織大部切除后，腎單位數(shù)量大大減少，而流經(jīng)腎的血流量變化不大，使殘余腎組織承壓增加，各種與炎癥反應相關的炎癥細胞大量浸潤，比如巨噬細胞，其可促進轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等促纖維化細胞因子釋放，然后通過上皮-間充質(zhì)轉化，促使肌成纖維細胞不斷分泌膠原纖維，膠原纖維的大量沉積可引起腎纖維化發(fā)生[8]。缺血再灌注損傷模型誘導的腎纖維化建模的原理主要是因為缺血組織在沒有恢復正常的代謝功能時，由于再次恢復血運而加劇對腎小球和腎小管等的組織損傷，在后期也可導致腎組織發(fā)生纖維化[9]。單側輸尿管梗阻手術建模的原理主要是輸尿管梗阻導致尿液不能正常排出而積聚于腎，從而導致腎腫大，腎小球濾過率減少，最后引起腎小管的快速萎縮、壞死和間質(zhì)中大量基質(zhì)堆積[10]。

1.1 腎組織大部切除術腎纖維化模型

制備方法：準備6～8周雄性大鼠，隨機分為假手術組和模型組，麻醉大鼠，手術操作臺固定，去除腹部毛發(fā)且暴露區(qū)域足夠大，75%乙醇對腹部區(qū)域進行消毒。模型組在距左脊肋角1～2 cm處斜向外方切一小口以暴露左腎，游離腎周圍脂肪組織，絲線結扎上、下極腎組織約1/3，1周后再次手術將整個右腎切除，2次手術一共切除5/6腎組織；假手術組大鼠只需劃一切口，不需切除腎組織。模型構建過程中，手術操作要求比較高，操作者應熟練整個手術流程。同時，腎是一個易出血的臟器，應重點做好止血準備。在建立模型后的2、4、8、12周分別取腎組織，通過H-E染色（hematoxylin-eosin staining ）、Masson三色染色（Massontrichrome staining）、PAS染色（periodic acid-schiff staining）及免疫組織化學方法觀察腎組織結構改變，主要觀察腎小球是否有局灶或全部硬化，腎小管是否有萎縮或擴張以及腎間質(zhì)纖維化的程度等[8-11]。

模型特點：該模型手術過程不算復雜，且可行性大，成功率也高。但是，手術存在出血、感染的可能，手術操作過程應注重止血、無菌操作。

模型應用：主要用于研究腎小球硬化導致的腎纖維化。Wen等[12]利用該模型，研究了青蒿素可通過NF-κB/NLRP3途徑減輕大鼠腎纖維化。另外，Zhu等[13]利用腎切除模型驗證了中藥（益氣化瘀通絡方）可通過影響Nrf2/Keap1信號通路，下調(diào)TGF-β1蛋白表達，從而減少殘余腎氧化應激損傷及纖維化程度。

1.2 缺血再灌注損傷腎纖維化模型

制備方法：準備6～8周雄性大鼠，隨機分為假手術組和模型組，麻醉大鼠后操作臺固定，剔除腹部毛發(fā)，并用75%乙醇進行消毒。打開腹腔后將雙側腎動脈鉗夾45 min，然后取下鉗夾進行再灌注24 h后，取血清和腎組織分別進行研究。操作時，嚴格把握鉗夾動脈血管的時間以及灌注時間，此步是該模型成功的關鍵。有研究證明，對照組血清乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和腎功能相關標記物如血清尿素氮（b1ood urea nitrogen，BUN）和肌酐顯著增加[14]；通過H-E染色、Masson三色染色和PAS染色，可以觀察腎組織結構變化和纖維組織含量變化（如是否有腎小球局灶或全部硬化、腎小管萎縮或擴張以及腎間質(zhì)纖維是否增加）[8]；通過免疫組織化學顯色可以觀察與腎纖維化相關標記物的表達情況，如α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和TGF-β1等的含量改變[15-16]。

模型特點：該模型建模耗費時間相對較短，操作方法最簡單，腎纖維化特征比較明顯。但是，該模型的缺血時間不易控制，缺血時間短暫，其造成的損傷是可逆的，缺血時間較長的話，其損傷是不可逆的。

模型應用：應用較廣，大多數(shù)用于研究腎小球硬化。Zhou等[17]通過構建缺血再灌注損傷腎纖維化模型驗證了CB2/β-catenin通路可促進腎纖維化，靶向抑制CB2或β-阻滯素1可抑制纖維化的進展。Qi等[18]發(fā)現(xiàn)C5a/C5aR1軸可促進小鼠腎缺血再灌注損傷后腎纖維化的進展。

1.3 單側輸尿管梗阻腎纖維化模型

制備方法：準備6～8周雄性大鼠，腹腔注射麻醉劑后，將其固定于操作臺上，用剃毛器去除腹部毛發(fā)，噴灑75%乙醇對腹部區(qū)域進行消毒，在左側腹部行一切口，充分暴露輸尿管，并游離周圍脂肪組織，切除左側輸尿管，并縫合結扎傷口；假手術組大鼠僅打開腹腔暴露輸尿管，并游離周圍脂肪組織，但不處理輸尿管，分別于手術后3 d、7 d和14 d取腎組織，通過H-E染色等觀察腎組織結構的改變[19-20]。手術操作時，應注意嚴格執(zhí)行無菌操作，保護好腎周圍組織，同時需要將腎放于原位，并逐層縫合。腎小管間質(zhì)損傷評分主要根據(jù)腎小管上皮細胞是否有空泡變性、壞死以及變性、壞死的比例；腎小管是否有擴張或萎縮；間質(zhì)纖維化病變程度；通過尿常規(guī)檢測尿中有無紅細胞管型和蛋白管型等；腎間質(zhì)相對面積測定主要是通過Masson染色法之后，計算膠原纖維藍染面積占整個腎間質(zhì)面積百分比；腎小管間質(zhì)α-SMA含量主要是通過圖像分析，計算棕黃色染色面積占整個腎間質(zhì)面積的百分比[21]。

模型特點：該模型操作步驟簡單，同時建模時間短，可多次重復建模且病變一致，成功率較高。該模型的缺點是，此模型不適用于研究腎小球硬化，并且在建模前期，需要多次摸索導致腎纖維化特征較明顯的時間點。

模型應用：主要適用于研究腎間質(zhì)纖維化。 Zhao等[22]通過構建單側輸尿管梗阻腎纖維化模型，驗證了L-肉堿可預防單側輸尿管梗阻模型中小管間質(zhì)炎癥和纖維化。另外，還有一些研究表明姜黃素[23]、雷公藤[24]等藥物可用于減輕單側輸尿管梗阻引起的腎纖維化。

2 腎纖維化的發(fā)病機制

當腎組織受損時，可促進以巨噬細胞為代表的炎癥細胞浸潤，進而這些炎癥細胞釋放各種與纖維化相關的細胞生長因子，導致間質(zhì)中大量膠原纖維沉積，使腎結構受損、功能減弱，是腎纖維化形成中的重要分子機制。目前對于腎纖維化發(fā)生機制的研究主要集中于以下幾條經(jīng)典的信號通路，通過對參與腎纖維化的信號通路的研究，可以發(fā)現(xiàn)新的分子靶點，為臨床腎纖維化的診斷與治療提供實驗基礎。

2.1 TGF-β1/Smad通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

TGF-β1是驅(qū)動腎纖維化的重要因素，可直接激活Smad信號轉導，引起下游與纖維化相關靶基因的過度表達。研究證實，TGF-β1/Smad通路的失調(diào)在腎纖維化發(fā)生中起重要作用[25]。

TGF-β是生長因子超家族的一部分，在哺乳動物中已經(jīng)鑒定出 3 種，其中對TGF-β1的研究最多。TGF-β1 及其2 種 TGF-β 受體 （TGF-β receptor，TGFβ-R）Ⅰ和Ⅱ在上皮間充質(zhì)轉化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）和纖維化中起關鍵作用[25]。在腎纖維化發(fā)展進程中，TGF-β1與其受體結合可以誘導Smad3發(fā)生磷酸化，從而觸發(fā)其下游與纖維形成緊密相關的基因如α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白（collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）、纖連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）等的表達，使膠原纖維在腎臟組織中大量沉積[26-27]。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

Wnt/β-catenin信號通路在進化上高度保守、復雜而關鍵，參與調(diào)控細胞命運、組織穩(wěn)態(tài)、器官發(fā)育、損傷和修復。它在正常成人腎中相對沉默，但在腎臟疾病患者和建立的腎纖維化的動物模型中，由于腎組織受到損傷，該信號通路被重新激活[28]，長時間和過量的信號通路激活可導致腎纖維化[29]。，Wnt/β-catenin信號通路的激活在慢性梗阻性腎病和腎間質(zhì)纖維化所致腎損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[30]。

Wnt家族中至少有19個Wnt家族成員對腎的發(fā)育至關重要，其缺失可導致各種腎臟疾病的發(fā)生[31]。Wnt蛋白可通過與Frizzed（Fzd）受體家族及其共受體LRP5/6相互作用，通過細胞膜傳遞信號，激活Disheveled（Dsh/DVL），進而將信號傳遞給β-連環(huán)蛋白（β-catenin）[31]，β-catenin在細胞核中募集后，與T細胞特定的轉錄因子（TCF）或淋巴增強因子（LEF）結合，調(diào)控Wnt下游基因的表達[32]。Wnt/β-catenin信號通路主要通過誘導其靶基因的表達而發(fā)揮生物學活性。近年來，大量與腎纖維化相關的靶基因包括FN、Snail1、基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）、成纖維細胞特異性蛋白1及RAS等組分相繼被發(fā)現(xiàn)[31-32]，并發(fā)現(xiàn)了幾種Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，包括可溶性Frizzed相關蛋白（SFRPs） 、Wnt抑制因子、Dickkopf（DKK）家族和抗衰老蛋白Klotho等。SFRPs與Frizzed序列具有同源性，可以在細胞外空間與Wnts結合和隔離，進而阻止其與Fzd受體結合；Wnt抑制因子和Klotho可與Wnt蛋白結合，并阻止其信號傳遞；DKK家族蛋白通過與LRP5/6共受體結合和內(nèi)化來拮抗Wnt/β-catenin信號通路的激活[28，33]。

2.3 Notch信號通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

Notch 信號通路的主要功能是調(diào)節(jié)細胞間的相互作用[34]。該通路主要由Notch配體、 Notch 受體以及Notch 的調(diào)節(jié)分子等組成。Notch配體包括Jagged 1（Jg1）、Jagged 2（Jg2）、Delta樣1（Dll1）、Delta樣3（Dll3）或Delta樣4（Dll4）。Notch 受體由 Notch 1、Notch 2、Notch 3或Notch 4組成[35]。這些受體在接受信號細胞的質(zhì)膜上，經(jīng)過糖基化、糖醛樣轉換酶和亞當金屬蛋白酶受體的第二次切割，配體與受體結合后再啟動第3次切割，然后Notch 受體胞內(nèi)的結構域被轉移到細胞核，與轉錄調(diào)節(jié)因子如Rbpj和Maml結合，促使相關基因的表達[36-38]。相關文獻證實，腎受損可引起Notch信號活性及Notch 受體表達增加，導致上皮脫分化、肌成纖維細胞活化和基質(zhì)沉積等[36]，從而引起腎纖維化改變。

在新生兒及成人階段Notch信號通路通常是被抑制的，如果發(fā)生腎損傷，該通路則被重新激活[29]。相關研究證實，Notch信號通路的異常激活與腎纖維化的發(fā)生密切相關[35]。

2.4 Hedgehog（Hh）信號通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

Hh信號通路比較復雜，它參與胚胎發(fā)育過程中多方面的調(diào)節(jié)，在組織內(nèi)平衡中起著決定性作用，當腎組織受損時，Hh信號通路被異常和持續(xù)地激活[39]。其激活主要直接靶向作用于腎纖維化發(fā)生的中心事件——肌成纖維細胞（大部分來源于腎間充質(zhì)干細胞樣細胞）的活化、增殖與轉化，提示該通路的激活與纖維化發(fā)生密切相關[40-41]。

Hh信號通路主要由Hh配體、Patched受體（Ptch受體）、共受體（Cdon/Ihog，Boc/Boi，Gas1）、換能器Smooth（Smo）及下游轉錄因子Gli組成，該通路分為經(jīng)典模式和非經(jīng)典模式通路[40]。在經(jīng)典模式通路中，當腎組織受損時，Hh信號增加，Hh在共受體輔助下與Ptch結合后下調(diào)Ptch的膜表達，從而使Smo在膜表面富集，Smo進行信號轉導使Gli與其抑制蛋白su fu及Cos2分離，從而開始活化與核轉位，最終激活靶基因，如Gli1、Ptch1、N-myc及細胞周期蛋白D/E等[39-40]。非經(jīng)典通路的特點是與配體無關的Ptch激活或Smo激活，通過TGF-β、Wnt等多信號的調(diào)節(jié)直接激活Gli使其轉錄。相關研究證實，Gli1可增加肌成纖維細胞的活性使其大量增殖，可還誘導EMT關鍵因子Snail1以及Twist1上調(diào)，上皮細胞發(fā)生EMT轉化，間質(zhì)中膠原纖維過度沉積引起腎臟纖維化的發(fā)生[39-42]。

盡管慢性腎臟疾病的發(fā)展過程比較緩慢，但最終都可引起腎纖維化的發(fā)生。在腎纖維化發(fā)生過程中，膠原纖維大量沉積，腎結構發(fā)生改變，可導致腎功能嚴重缺失。腎纖維化過程是否可以逆轉，取決于參與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展過程的各種因素，因此研究其發(fā)生機制尤為重要。本綜述總結了幾種常見的通過外科手術建立腎纖維化動物模型的方法，以及參與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展過程的幾條經(jīng)典的信號通路，以期為關注腎纖維化的研究者提供一些參考。通常情況下，如果研究者主要關注腎小球硬化型的腎纖維化，一般選用通過腎大部切除術或者腎缺血再灌注來建立腎纖維化的動物模型；如果研究者主要研究腎間質(zhì)纖維化，一般建議通過單側輸尿管梗阻建立腎纖維化的動物模型。目前，臨床上對于腎纖維化的患者仍缺乏效果良好的治療方法，通過腎纖維化的動物模型以研究腎纖維化的發(fā)生機制可以有助于該疾病相關新藥研發(fā)和更有效精準的治療。醫(yī)學研究人員通過建立各種腎纖維化的動物模型來研究腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展機制，尋找參與腎纖維化的信號通路；藥物研發(fā)人員以這些信號通路中的分子為靶點，研發(fā)相應信號分子的激動劑或抑制劑，開發(fā)可能應用于治療人類腎臟纖維化的藥物，減輕或防止腎臟纖維化的發(fā)生。