乳牙牙髓干細胞在口腔組織再生修復(fù)中的研究進展

李佩 林凌 趙瑋

中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科 廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室 廣州 510055

口腔頜面部的軟硬組織損傷嚴重影響患者口腔頜面部的形態(tài)及功能，微創(chuàng)且快速的軟硬組織修復(fù)再生是臨床治療的目標。創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，臨床常用各種皮瓣或組織移植術(shù)，或者用生物相容性良好的材料替代缺損組織從而恢復(fù)功能，但存在缺點如二次損傷、不美觀、周期長、費用高或異物感強等問題，因此口腔頜面部的軟硬組織損傷修復(fù)再生仍是當前口腔醫(yī)學(xué)面臨的一個重要挑戰(zhàn)。

近年來，利用組織工程方法修復(fù)組織缺損取得了較大進展，它涉及種子細胞、支架材料及生物活性因子等的有機結(jié)合，其中種子細胞是組織工程的核心成分。乳牙牙髓干細胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）是從人類乳牙殘留牙髓中分離出來的、具有高度自我更新和增殖分化能力的一類間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)同源，表現(xiàn)出極好的神經(jīng)分化潛力[1]。從再生醫(yī)學(xué)的角度看，SHED是最有價值的一種MSC，因為隨著年齡增長，干細胞數(shù)量和質(zhì)量均會下降，而相對于其他MSC，SHED細胞較接近胚胎特征；此外，SHED容易取得，可長期保存，體外擴增速度快，多系分化能力類似于其他MSC，甚至更勝一籌[2]。

SHED在干細胞治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，本文就近期SHED在口腔組織修復(fù)中的研究結(jié)果進行回顧總結(jié)，闡述其應(yīng)用優(yōu)勢和可能的作用機制，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 SHED的干性維持與分化調(diào)控

2003年，Miura等[3]從脫落的乳牙殘余牙髓中分離出獨特的多能干細胞群體。每個脫落的前牙約能形成12～20個細胞集落。較多研究[1-12]表明：與其他來源的MSC相比，SHED表現(xiàn)出更高的增殖速率，且能高度表達幾乎所有MSC的表面標記。培養(yǎng)和保存技術(shù)對干細胞的持續(xù)性研究及應(yīng)用具有重要意義，目前普遍認為長期冷凍保存乳牙的牙髓組織是一種無害且可行的干細胞臨床儲備方法。SHED在液氮中冷凍保存2年以上仍能保持最初的干細胞特性[13]。但干細胞經(jīng)過長期培養(yǎng)也可能面臨衰老，長期體外培養(yǎng)和傳代的干細胞衰老涉及多種途徑，可能與p53、p21和p16Ink4a的表達有關(guān)[14]，因此如何維持細胞干性十分重要。研究發(fā)現(xiàn)：低氧條件下的培養(yǎng)可能有助于維持SHED的靜止狀態(tài)并增加多能基因（OCT4、SOX2和NANOG）的表達[9]，氯化鈷可以協(xié)助低氧環(huán)境下的SHED保持細胞干性、抑制分化，且無明顯細胞毒性[15]。另有研究者[16]嘗試構(gòu)建永生細胞系，Bmi-1誘導(dǎo)的細胞永生化不會影響SHED的主要特征，能長時間傳代并穩(wěn)定表達干細胞特征，是用于長期研究的潛在工具。適當改變SHED的微環(huán)境可促進其分化過程。有學(xué)者[17]使用成纖維細胞系條件培養(yǎng)基和3D絲素蛋白多孔支架并同時對培養(yǎng)細胞施加機械應(yīng)力的動態(tài)循環(huán)系統(tǒng)可促使SHED分化出高活力的干細胞球，其功能性蛋白合成更高。該作者認為：傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)的共培養(yǎng)物中只有少量生長因子，不足以模擬體外干細胞的分化，而動態(tài)循環(huán)系統(tǒng)中成纖維細胞系條件培養(yǎng)基生長因子濃度更高，從而避免了向培養(yǎng)基中添加其他化學(xué)試劑或生長因子的需求，是促使SHED分化更簡便和更經(jīng)濟的一種方法。有研究者[11]通過使SHED穩(wěn)定表達缺氧誘導(dǎo)因子1α，增強了其血管生成的自分泌和旁分泌信號，具體表現(xiàn)為內(nèi)皮分化能力增強，形成的脈管系統(tǒng)比用人臍靜脈內(nèi)皮細胞形成的更高，提示了SHED取代人臍靜脈內(nèi)皮細胞成為血管再生種子細胞的潛力。另外，660 nm波長的InGaAlP二極管激光不僅促進SHED增殖，也能使其表達更多血管內(nèi)皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）、VEGF-A和胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）等血管生成蛋白[18]，發(fā)揮促血管生成作用。

2 SHED在口腔組織再生修復(fù)中的直接應(yīng)用

2.1 SHED在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生中的應(yīng)用

早在2003年，有研究者[3]就發(fā)現(xiàn)SHED能分化為成牙本質(zhì)細胞，但不能形成完整的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，即不能形成真正意義上的牙髓組織，該作者認為是其過于“幼稚”的緣故。近年來，研究者們嘗試了多種輔助支架以實現(xiàn)牙髓再生，且成功利用SHED構(gòu)建出了牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。體外實驗證明：SHED結(jié)合可注射、可降解支架（肽水凝膠、Ⅰ型膠原蛋白、聚乳酸）[19-21]注入根管后，可以產(chǎn)生功能性的牙髓，表現(xiàn)出與正常牙髓相似的細胞性和血管化，包含成牙本質(zhì)細胞的牙髓樣組織能在整個根管壁以約10 μm·d-1的速度產(chǎn)生新的牙本質(zhì)，有助于牙髓壞死的年輕恒牙的牙根形成。另外，釉基質(zhì)蛋白衍生物（enamel matrix derivative，EMD）、礦物三氧化物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）和Biodentine能 增 強SHED的細胞活力，增強礦化和牙本質(zhì)唾液蛋白表達，其中EMD表現(xiàn)最佳[12]。

值得注意的是，SHED與促使其分化的微環(huán)境缺一不可，支架本身并不能誘導(dǎo)SHED向牙本質(zhì)細胞分化，即牙本質(zhì)來源的信號分子對分化是必需的；而在沒有SHED的條件下，信號分子誘導(dǎo)宿主細胞形成的牙髓結(jié)構(gòu)紊亂，提示在無細胞組織工程學(xué)中，信號分子可能要結(jié)合到支架中，進而從根尖周區(qū)主動募集細胞[20]。理想的細胞黏附支架應(yīng)具有為干細胞提供穩(wěn)定的附著位點、可緩慢降解和為干細胞提供血管化條件等特點。研究者們試圖通過各種方法改造支架從而增強其性能，提高干細胞的黏附率和增殖分化效率，比如通過壓縮提高其膠原蛋白密度或在支架上添加生長因子[12,19]，但技術(shù)敏感度較高，目前尚未出現(xiàn)臨床效果確定的支架材料。而在牙髓血管生成過程中，除了支架和干細胞，另一重要角色則是細胞間的通訊工具如外泌體和細胞因子，誘導(dǎo)SHED成牙本質(zhì)向分化和形成新生血管。外泌體依托表面的特異性蛋白識別靶細胞如血管內(nèi)皮細胞，再將囊泡中的促血管生成信號釋放到靶細胞中，從而觸發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)[22]；眾多的細胞因子如VEGF等則參與內(nèi)皮細胞的增殖、遷移，或激活相關(guān)信號通路來促進SHED向成牙本質(zhì)或血管內(nèi)皮細胞分化，較多研究[23-26]發(fā)現(xiàn)：Eph/ephrinB和Wnt/β-catenin信號通路參與SHED向成牙本質(zhì)細胞分化和血管內(nèi)皮細胞分化的過程，這些作用最終都促進牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的形成。

2.2 SHED在牙周組織再生中的應(yīng)用

有研究[27-28]發(fā)現(xiàn)：SHED能刺激單核巨噬細胞向抗炎表型（M2型）巨噬細胞的轉(zhuǎn)化，減少破骨細胞的產(chǎn)生，抑制炎性因子干擾素-γ（interferonγ，INF-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）表達，從而減少牙齦出血，增加牙周膜新附著的產(chǎn)生，縮短釉牙骨質(zhì)界與牙槽嵴頂之間的距離，這項研究利用大鼠牙周炎模型證明了SHED的局部傳遞得益于M2巨噬細胞極化的誘導(dǎo)。進一步地，SHED聯(lián)合牙本質(zhì)基質(zhì)成功移植實現(xiàn)了牙周組織的體內(nèi)再生，該牙周組織由新生的牙周膜、血管和牙槽骨組成[29]。有研究者[8]認為：SHED對牙周炎的抑制作用可能與其在促炎細胞因子刺激下高表達的β-防御素4有關(guān)，β-防御素4具有抗炎和抗菌活性，對牙齦卟啉單胞菌敏感，還能通過調(diào)節(jié)Notch途徑增強SHED的成骨和成牙本質(zhì)細胞分化潛能。SHED移植為牙周-牙髓聯(lián)合病變和再植牙的牙周膜愈合提供了新的解決思路，需要進一步工作去探究其可行性及有效性。

2.3 SHED在骨再生中的應(yīng)用

相比于其他來源的MSC，SHED在成骨條件培養(yǎng)下旁分泌活性更強，促血管生成特征更明顯[3,14,30-33]，有利于類骨質(zhì)的生成。與人牙髓干細胞和骨髓MSC相比，其在重建牙槽骨時，新生的類骨質(zhì)最多、膠原纖維分布最廣泛[31]，不僅早期類骨質(zhì)生成速度快，還可增強晚期骨礦化程度，可能是因為SHED分泌的堿性成纖維細胞生長因子（basic fibrobast growth factor，bFGF）通過平衡磷酸鹽和焦磷酸鹽的比例從而調(diào)控礦物質(zhì)沉積的量[33]，而體外添加不同濃度的氯己定則會在一定程度上抑制SHED的礦化潛力[34]。

為了提高SHED的成骨分化效率，較多研究旨在創(chuàng)造最適合的成骨分化的微環(huán)境，涉及多種新型材料、技術(shù)、支架和生長因子的聯(lián)合使用。有研究者[10]使用間接親和力固定技術(shù)將Notch配體Jagged-1和Delta樣配體蛋白（delta-like 1 protein，Dll-1）固定在組織培養(yǎng)表面，在接種于Jagged-1表面的細胞群中，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的量及活性、Ⅰ型膠原蛋白表達和礦化作用顯著增加，而接種于Dll-1表面的細胞群促進成骨分化效果不明顯。另有實驗[35]證明：氧化石墨烯量子點誘導(dǎo)了SHED的成骨分化，而氧化石墨烯呈現(xiàn)輕微抑制作用，這與石墨烯衍生物的濃度、合成方法和氧化程度都有密切關(guān)系，該作者認為SHED的成骨分化途徑是通過吸收氧化石墨烯衍生物從而使細胞質(zhì)中β-catenin的蛋白水平上調(diào)，并激活Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。

許多研究者[13,25]為了驗證SHED的成骨作用開展了動物實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：利用羥磷灰石/磷酸三鈣（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）移植載體能重建骨小梁，改善骨質(zhì)疏松和修復(fù)免疫受損小鼠的顱骨缺損；同時，碳酸鹽磷灰石支架生物相容性強，具有誘導(dǎo)骨生成和骨傳導(dǎo)的能力，能誘導(dǎo)出適合成骨分化的微環(huán)境，可能和骨蛋白酶和核因子κb受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）的表達情況有關(guān)[36]。還有學(xué)者[37]自制可快速降解的鈣磷纖維支架，利用了月桂酰氯提高礦物相在聚左旋乳酸（poly-l-lactic acid，PLLA）聚合物基質(zhì)中的分散性，并結(jié)合不影響材料力學(xué)性能的電紡絲法，研究證明適合乳牙干細胞生長。另外，有研究者[5]將SHED植入拔牙位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：其能明顯修復(fù)牙槽骨缺損，增強骨重建過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）和BMP-7的表達，同時減弱基質(zhì)金屬蛋白-8（matrix metalloproteinases-8，MMP-8）的表達。但值得思考的是，這種適合分化的微環(huán)境也會受到本身病理條件的影響，如何讓SHED在炎癥環(huán)境中保持高效的增殖分化和旁分泌活動仍需要更深入的研究。

3 SHED在口腔組織再生修復(fù)中的其他應(yīng)用

3.1 SHED在神經(jīng)保護中的應(yīng)用

由于SHED與中樞神經(jīng)系統(tǒng)同源，因此其表現(xiàn)出極好的神經(jīng)分化潛力，能表達與神經(jīng)保護、軸突伸長和神經(jīng)祖細胞有關(guān)的蛋白，對神經(jīng)變性和炎癥都有治療作用[1,7,38-39]。Kitase等[38]探究了SHED對大鼠缺氧缺血性腦病的治療效果，在靜脈用藥的情況下，受損皮層只檢測到少量的SHED，即使如此，M1型小膠質(zhì)細胞的比例也明顯降低，而M2型增加，伴隨明顯降低的炎性反應(yīng)，在后續(xù)行為測試中大鼠的肢體活動性和耐力都表現(xiàn)更好。進而，作者用氧和葡萄糖缺乏的神經(jīng)元培養(yǎng)實驗證實了SHED的神經(jīng)保護作用。在腦外傷小鼠模型中，SHED可以顯著減少活化小膠質(zhì)細胞釋放的炎癥因子如白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和TNF-α。同時，外傷中產(chǎn)生的具有神經(jīng)毒性的亞硝酸鹽濃度降低，可能與無細胞分泌物中外泌體的調(diào)節(jié)有關(guān)[39]，相比于使用SHED共培養(yǎng)系統(tǒng)，純化的外泌體本身可能對炎癥的減輕作用更大。

3.2 SHED在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用

損傷修復(fù)和組織再生離不開炎癥的控制，目前較多研究支持MSC的炎癥調(diào)節(jié)作用是一把“雙刃劍”，包括抗炎和促炎作用，在炎癥反應(yīng)強烈的情況下，口腔MSC通過直接接觸或旁分泌效應(yīng)調(diào)節(jié)炎癥細胞、炎癥細胞因子，RANKL/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和破骨細胞來抑制炎癥產(chǎn)生和骨吸收，防止免疫反應(yīng)過度表達；當處于低炎癥水平時，口腔MSC可促進炎癥產(chǎn)生和骨骼吸收[40]。MSC影響多種免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞（包括CD3+、CD4+和CD8+、T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T細胞等）的活動，它們的相互作用調(diào)節(jié)了局部炎癥微環(huán)境，但也可能影響MSC的遷移、歸巢、增殖和分化能力[6,40]，涉及的多種炎癥因子較為復(fù)雜，尚不明確。有研究者認為SHED在免疫治療中相對于其他MSC較有優(yōu)勢。首先，其受免疫細胞影響較小，Whiting等[41]測定了不同口腔干細胞對活化自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）毒性的敏感度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SHED在多種濃度的NK細胞環(huán)境中都能保持較好的活性，且在體內(nèi)抑制輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）免疫應(yīng)答和在體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞擴增方面都優(yōu)于骨髓源的MSC[6]。

4 小結(jié)

綜上所述，SHED在口腔組織再生修復(fù)的應(yīng)用中有許多優(yōu)勢，如易取、無創(chuàng)、較少倫理爭議，且可以實現(xiàn)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體和牙周組織再生，并發(fā)揮神經(jīng)保護和炎癥控制等多方面作用。但在SHED的臨床應(yīng)用前還有許多需要考慮的地方，如有研究[42]發(fā)現(xiàn)：鎵鋁砷化鎵（GaAlAs）二極管激光照射、次氯酸鈉、臭氧水和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對SHED可能存在細胞毒性作用，作用大小還需取決于具體的劑量和濃度，所以研究者應(yīng)思考清理根管的材料是否影響SHED的活性。另外，即使低劑量的錐形束CT（cone beam CT，CBCT）檢查也有潛在風(fēng)險，電離輻射會導(dǎo)致SHED的DNA損傷和持續(xù)的炎癥反應(yīng)[43]，這使得可行的判定療效的方法十分重要。除了SHED移植治療外，干細胞的外泌體作為干細胞發(fā)揮作用的重要介質(zhì)，可以發(fā)揮和干細胞相似的療效，從而作為一種無細胞治療策略為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供一種新的思路，SHED衍生的外泌體的無細胞治療可能也是一種理想的口腔組織再生與修復(fù)方式。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。