內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—凋亡途徑與卵巢衰老關(guān)系研究進展

蘇娜，蔡平平，嚴如根，李長忠 ，曹云鳳

1 山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，濟南 250014；2 山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院婦科；3 山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院中醫(yī)科；4 山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院檢驗科

卵巢衰老指女性卵巢儲備功能逐漸衰退直至衰竭的過程，表現(xiàn)為卵泡數(shù)量減少和卵母細胞質(zhì)量下降，從而影響卵巢內(nèi)分泌功能和生育能力。據(jù)其進展程度、出現(xiàn)年齡等方面的不同，臨床將其分為卵巢儲備功能減退（DOR）、早發(fā)性卵巢功能不全（POI）及卵巢早衰（POF）等疾病。卵巢衰老被喻為女性機體衰老的起搏器，是多個器官衰老的始動因素。因此，對于卵巢衰老的早期識別和干預(yù)至關(guān)重要。卵泡的生長發(fā)育需要卵母細胞和顆粒細胞（GCs）的相互作用。卵泡閉鎖是哺乳動物卵巢GCs和卵母細胞丟失及卵巢衰老的主要過程之一，其中GCs 凋亡是卵泡閉鎖的前提，且凋亡與否直接影響卵母細胞的發(fā)育潛能。因此，二者的凋亡是卵泡閉鎖卵巢衰老的關(guān)鍵。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）-凋亡途徑作為近幾年新發(fā)現(xiàn)的凋亡路徑，被證實參與卵泡的生長發(fā)育閉鎖，但在卵巢衰老中的具體作用機制尚存爭議，值得進一步研究探索。針對ERS-凋亡途徑的靶向干預(yù)治療也有望成為臨床預(yù)防或延緩卵巢衰老的創(chuàng)新治療方法。本文就ERS-凋亡途徑與卵巢衰老發(fā)生發(fā)展的關(guān)系作一綜述，以期為卵巢衰老發(fā)病機制提供思路，亦為其尋找新的潛在治療靶點。

1 ERS-凋亡途徑的誘因與卵巢衰老的關(guān)系

卵巢衰老是一個受多因素影響的復(fù)雜生物學過程，目前病因仍不明確。年齡、環(huán)境、生活方式、醫(yī)源性、免疫等因素均可通過直接或間接途徑損害卵泡數(shù)量和質(zhì)量，導(dǎo)致卵巢儲備功能下降，加速卵巢衰老進程，但不同影響因素在機制方面可能有相通之處。例如，各病理因素（如氧化損傷、炎癥反應(yīng)等）均可激活ERS，觸發(fā)促凋亡途徑，誘導(dǎo)加速GCs或卵母細胞凋亡，最終導(dǎo)致卵巢衰老。

1.1 氧化應(yīng)激 ERS與氧化應(yīng)激相互作用，共同介導(dǎo)細胞凋亡過程，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。高血糖是卵巢功能異常的主要致病因素，先前的報道大多認為糖尿病可引起氧化應(yīng)激并導(dǎo)致DNA 損傷，進一步引發(fā)細胞周期停滯并致GCs 凋亡，從而抑制卵母細胞成熟［1］。而 WU 等［2］卻認為除誘導(dǎo) DNA 損傷外，糖尿病還可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激進而激活ERS，以加速卵巢GCs 凋亡。這與鎘誘導(dǎo)GCs 凋亡［3］的病理機制高度吻合。

1.2 Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡 理論上，維持GCs 的正常生理功能依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的Ca2+穩(wěn)態(tài)，而Ca2+可能是卵巢GCs 中ERS 的誘發(fā)因素之一［4］?？缒そY(jié)構(gòu)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域1蛋白（TMCO1）是一種ER跨膜蛋白，可主動防止Ca2+儲存過度填充。TMCO1敲除的雌性小鼠多表現(xiàn)為卵巢卵泡發(fā)育受損以及類似于POF表型的生育力低下，提示TMCO1對維持卵巢卵泡發(fā)育和生育能力至關(guān)重要；其破壞可造成GCs 中Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，加速ERS 介導(dǎo)的細胞凋亡，從而導(dǎo)致卵巢卵泡發(fā)育受損［4］。有研究報道，UFL1 基因負責啟動卵巢GCs中的ERS和卵巢早衰；究其本質(zhì)，也與其抑制TMCO1 通道，破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)，進而啟動ERS-凋亡途徑相關(guān)［5］。

雙氫青蒿素（DHA）作為青蒿素的重要衍生物，可通過誘導(dǎo)凋亡、調(diào)控細胞周期、加速細胞氧化損傷等發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，LUO 等［6］的研究結(jié)果卻顯示DHA 暴露可導(dǎo)致GCs 中ATP 濃度增加，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）轉(zhuǎn)錄水平提高；因此推測DHA可通過增加細胞內(nèi)Ca2+的產(chǎn)生，擾亂Ca2+穩(wěn)態(tài)引發(fā)ERS，進而誘導(dǎo)GCs凋亡。

1.3 炎癥反應(yīng) 卵巢儲備功能與卵巢炎癥密切相關(guān)，持續(xù)的炎癥可加速卵巢衰老，減少卵巢儲備。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是炎癥調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，NF-κB 信號通路對于維持卵泡發(fā)育、GCs 正常生理功能不可或缺。LUO 等［7］的研究首次闡釋了 NF-κB 信號通路在POF 發(fā)展中的影響，即NF-κB 信號失活可通過GRP78 引起的ERS 失衡加速GCs 凋亡，進一步導(dǎo)致竇性卵泡減少并最終導(dǎo)致POF。

2 ERS-凋亡的途徑與卵巢衰老的關(guān)系

氧化損傷、炎癥反應(yīng)等不同病理因素均可激活ERS-凋亡途徑，誘導(dǎo)加速GCs 或卵母細胞凋亡，導(dǎo)致卵巢儲備功能下降，然而不同因素導(dǎo)致的卵巢衰老可由不同ERS-凋亡途徑介導(dǎo)。

2.1 CHOP 途徑與卵巢衰老 CHOP 是 ERS-凋亡途徑的重要組成部分，也被稱為生長阻滯和DNA 損傷誘導(dǎo)基因153（GADD153）或DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因（DDIT3），屬于CCAAT/增強子結(jié)合蛋白（C/EBPs）家族，其過表達可使細胞周期停滯并導(dǎo)致細胞凋亡。CHOP 缺陷模型中ERS 誘導(dǎo)的細胞凋亡明顯減少［8］?？傊?，CHOP在促進ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡中起重要作用，且主要通過蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）/真核起始因子2α（eIF2α）/ATF4 信號和（或）活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）信號誘導(dǎo)啟動。近年來，由CHOP 途徑誘導(dǎo)的細胞凋亡與婦科疾病的相關(guān)性備受關(guān)注。LIN 等［9］研究了 CHOP 和 GRP78 在山羊閉鎖卵泡中的定位，發(fā)現(xiàn)在早期或進展閉鎖卵泡的GCs 中均檢測到二者的存在；隨后的機制研究進一步證實，未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR）的PERK/eIF2α/ATF4及ATF6信號通路均參與了卵泡閉鎖的病理過程，并通過上調(diào)CHOP 表達啟動GCs 凋亡以致卵泡閉鎖，從而損傷卵巢功能。

PERK 是一種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶，在ERS中通過自身二聚化和磷酸化激活。有活性的PERK可磷酸化真核起始因子 2α（eIF2α），減弱mRNA 翻譯，抑制蛋白質(zhì)的合成；磷酸化的eIF2α 進一步激活轉(zhuǎn)錄激活因子4（ATF4）的翻譯，刺激下游促凋亡因子CHOP 的表達，從而加速細胞凋亡。一項研究表明［3］，大鼠卵巢 GCs 用鎘處理 12 h 后，可觀察到 p-PERK、p-eIF2α、CHOP mRNA 和蛋白水平上調(diào)，提示鎘誘導(dǎo)的GCs凋亡可能是通過激活ERS的PERK/peIF2α/ATF4/CHOP 通路介導(dǎo)的。DHA 誘導(dǎo)的生殖毒性機制與其相似，通過激活PERK/eIF2α/ATF4分支而致GCs凋亡［6］。

CHOP 也是ATF6 的主要下游靶標。作為ERS信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵參與者，ATF6 可從調(diào)節(jié)GCs 凋亡、細胞周期、類固醇激素合成等多方面影響卵泡發(fā)育。藍藻代謝產(chǎn)生的微囊藻毒素LR（MC-LR）不僅可以直接作用于卵巢、睪丸等生殖器官，還可通過破壞下丘腦—垂體—性腺軸間接影響性激素，具有嚴重的生殖毒性。暴露于MC-LR 的小鼠性腺指數(shù)降低，同時伴隨 DDIT3、ATF6、肌醇需求因子1（IRE1）表達的上調(diào)。這提示除IRE1通路以外，MC-LR誘導(dǎo)的GCs 凋亡和卵泡閉鎖還可能與ATF6 凋亡途徑有關(guān)［10］。

2.2 JNK 途徑與卵巢衰老 JNK 介導(dǎo)的凋亡通路主要由IRE1 信號啟動。與PERK 和ATF6 相似，IRE1 作為ER 的壓力傳感器，在應(yīng)激狀態(tài)下與GRP78 分離后自磷酸化以激活其核酸內(nèi)切酶活性。肌醇需求因子1α（IRE1α）被激活后，啟動轉(zhuǎn)錄的特異性剪接 X 盒結(jié)合蛋白 1（XBP1）mRNA，剪接的XBP1 mRNA 編碼功能蛋白XBP1s，并通過抑制蛋白質(zhì)翻譯解決未折疊蛋白的超載問題進而恢復(fù)細胞穩(wěn)態(tài)。然而，過度或持續(xù)的ERS仍會觸發(fā)細胞凋亡。

目前，許多因素所致的GCs 凋亡均與IRE1α/JNK 信號通路的激活相關(guān)。在POF小鼠卵巢中觀察到 IRE1α、XBP1 及 GRP78 蛋白水平顯著上調(diào)，表明IRE1α 信號通路過度激活可能是誘導(dǎo)POF 小鼠GCs凋亡的關(guān)鍵機制［11］。此外，MA 等［12］首次發(fā)現(xiàn)MC-LR 可顯著激活 IRE1 通路（IRE1、XBP1 和 JNK）誘導(dǎo)卵巢損傷，為MC-LR 的生殖毒性提供了新見解。然而，在GalT-/-誘導(dǎo)的卵巢老化小鼠模型中，伴侶分子免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BIP）、PERK 和peIF2α 均升高，然而并未誘導(dǎo) IRE1α 激活下游的XBP1，推測UPR的PERK分支而不是IRE1α 分支在GalT-/-卵巢中被激活。

此外，活化的IRE1 不僅具有核酸內(nèi)切酶活性，同時也有激酶活性，可介導(dǎo)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF2）的激活，刺激凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）/JNK 級聯(lián)效應(yīng)，從另一途徑介導(dǎo)細胞凋亡［13］。IRE1/ASK1/JNK 通路屬于 ERS-凋亡途徑的重要一環(huán)，并參與多種疾病的病理過程。例如，地諾孕素誘導(dǎo)的ERS 通過激活I(lǐng)RE1/TRAF2/ASK1/JNK信號傳導(dǎo)增加CHOP 表達，從而影響子宮內(nèi)膜異位癥基質(zhì)細胞的凋亡、增殖和侵襲［14］；熊果酸誘導(dǎo)ERs激活A(yù)SK1-JNK 信號，并誘導(dǎo)人膀胱癌T24 細胞凋亡［15］。但是，此凋亡途徑是否參與卵巢衰老的發(fā)生發(fā)展仍未可知，可以作為下一步的研究重點。

2.3 Caspase-12 途徑與卵巢衰老 Caspase 是一個保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在程序性細胞死亡和炎癥中起關(guān)鍵作用［16］。其中Caspase-12 作為Caspase 家族成員之一，定位于ER，屬于ERS 的特異性信號分子。正常情況下，Caspase-12 處于無活性狀態(tài)，只有在某些特定條件下才被ERS 激活進而啟動凋亡程序，且不參與線粒體途徑和死亡受體途徑介導(dǎo)的凋亡，缺乏Caspase-12 的小鼠對ERS 誘導(dǎo)的細胞凋亡具有明顯抗性。

以不同方式誘導(dǎo)的卵巢衰老小鼠為模型，研究Caspase-12 途徑在此病理過程中發(fā)揮的作用。不管在免疫誘導(dǎo)的POF 小鼠卵巢組織中［16］，或在體外暴露于多柔比星的小鼠卵母細胞中，均發(fā)現(xiàn)Caspase-12表達水平明顯升高。多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）是一種廣泛存在于環(huán)境中的新型持久性有機污染物，可作用于人體不同靶器官發(fā)揮毒性效應(yīng)。生殖毒理學實驗表明，2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚（PBDE-47）屬于PBDEs 的主要同系物，可在人體中蓄積且具有明顯生殖毒性［17］；同樣PBDE-47 暴露可降低小鼠卵巢系數(shù)，且增加 GRP78、Caspase-12 等 ERS 標志物的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡［18］。而另一項以半乳糖誘導(dǎo)的卵巢衰老小鼠為模型的研究則發(fā)現(xiàn)，參與ERS 通路的CHOP、Caspase-12 及與促凋亡相關(guān)的Bax 蛋白水平均升高［19］。此外，OKAN 等［20］發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者的卵巢中，UPR 通過 Caspase-12 和 Caspase-3 的共激活觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。以上體內(nèi)外實驗均表明，ERS 介導(dǎo)的Caspase-12 特異性凋亡途徑可能在不同因素所致的卵巢細胞凋亡中發(fā)揮作用。

3 ERS-凋亡途徑的調(diào)控與卵巢衰老防護

ERS 介導(dǎo)的凋亡與卵巢衰老關(guān)系密切，因此基于調(diào)控ERS-凋亡途徑以改善卵巢功能的潛在治療藥物和靶點也需進一步開發(fā)研究。其中，某些化合物或干預(yù)措施已被證實可通過靶向處理通路關(guān)鍵因子等緩解ERS，進而改善細胞凋亡并延緩卵巢衰老。

BALAKRISHNAN 等［21］用Salubrinal（一種eIF2α磷酸酶抑制劑）治療GalT-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)UPR 相關(guān)因子 BIP、p-PERK 和 p-eIF2α 表達水平均下調(diào)。這表明Salubrinal 的卵巢功能保護機制可能與ERS-凋亡路徑相關(guān)，尤其是PERK/eIF2α 通路。過氧化物還原酶4（Prdx4）作為一類抗過氧化物酶，主要定位在ER，可消除過氧化氫、抑制氧化應(yīng)激并促進氧化蛋白質(zhì)折疊［22］。在d-gal誘導(dǎo)的卵巢衰老小鼠模型中，Prdx4 缺乏會通過增加卵泡閉鎖和HPO 軸障礙等加速卵巢衰老；反之，Prdx4 可通過抑制ERS 相關(guān)凋亡途徑，尤其是CHOP 及Caspase-12 途徑，抑制卵巢GCs 凋亡，減緩小鼠卵巢衰老進程，可作為一種POF保護劑［19］。在體外研究中，鄒小飛等［23］通過免疫熒光共定位明確Prdx4 定位于GCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，下調(diào)Prdx4蛋白表達可引起GCs 的ERS，從而促進GCs 凋亡，表明Prdx4 作為ER 抗氧化劑，可通過維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，下調(diào)ERS 水平，從而抑制GCs 的凋亡。此外，Protegrin-1（一種抗菌肽）可通過 PERK/eIF2α/CHOP 信號通路抑制氧化應(yīng)激引起豬卵巢GCs 凋亡［24］；褪黑素可使暴露于鎘的卵巢ERS 相關(guān)蛋白GRP78、ATF4、CHOP 和 p-JNK 表達下調(diào)，減輕細胞毒性，減少GCs凋亡，提示褪黑素可以成為保護卵巢免受鎘毒性影響的潛在藥物［25］。而在皮下注射透明帶抗原3（ZP3）誘導(dǎo)的自身免疫性POF 小鼠模型中，人胎盤間充質(zhì)干細胞（hPMSCs）移植可明顯下調(diào)IRE1α、XBP1、GRP78及Caspase-12表達；因此，該研究推測hPMSCs 移植可能通過抑制IRE1α 通路的過度激活，減少GCs凋亡，改善卵巢功能［11］。上述系列實驗表明，預(yù)處理ERS-凋亡途徑或靶向處理通路關(guān)鍵蛋白，可顯著降低ERS 相關(guān)基因表達，抑制卵巢細胞凋亡，改善卵巢功能。

綜上所述，在不同因素所致卵巢衰老的發(fā)生、發(fā)展過程中都有ERS-凋亡途徑的參與。ERS 與氧化應(yīng)激、炎癥因子、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等病理因素相互影響，并主要從 CHOP、JNK、Capcase12 三條經(jīng)典凋亡途徑共同參與介導(dǎo)卵巢細胞凋亡。因此，臨床上如何有效調(diào)節(jié)ERS-凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白的表達，改善ERS狀態(tài)從而減少細胞凋亡，保護卵巢功能，將為卵巢衰老的防治提供潛在的靶向治療方向。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可以通過多途徑、多靶點對ERS-凋亡途徑進行調(diào)節(jié)進而治療各種疾病，具有很大的治療潛力。例如，補腎解郁調(diào)沖方通過PERKATF4-CHOP 信號通路降低多囊卵巢綜合征慢性應(yīng)激模型大鼠GCs 凋亡［26］；復(fù)方丹參滴丸通過調(diào)控IRE1-TRAF2-ASK1-JNK 通路降低ERS 保護血管平滑肌細胞。然而，中草藥是否可以通過調(diào)節(jié)ERS 相關(guān)通路以抑制細胞凋亡進而改善卵巢儲備功能，仍未有研究涉及，值得進一步驗證探索。