蛋白酶的研究歷史、發(fā)現(xiàn)及在健康和疾病中的作用(續(xù)1)

范美紅 譯自.，Vol.294(2019)，№5：1643～1651

王晶晶 審

3 金屬蛋白酶特性和生理功能的研究進(jìn)展

金屬蛋白酶已經(jīng)成為一組引人關(guān)注的酶。它們存在于所有生物界中，并在進(jìn)化過(guò)程中廣泛擴(kuò)展。1980 年，研究人員共鑒定出11 種金屬蛋白酶。目前，已知小鼠和人類(lèi)的基因組編碼了大約200種金屬蛋白酶，是蛋白酶領(lǐng)域中最大的一組酶。這些酶中大多數(shù)由細(xì)胞分泌或與質(zhì)膜相結(jié)合，在細(xì)胞周?chē)图?xì)胞外發(fā)揮作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，它們參與組織的分化和重塑，在成年組織中參與加工具有生物活性的肽和細(xì)胞因子。用于控制血壓的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是人類(lèi)使用最廣泛的抑制劑之一。金屬蛋白酶還與許多疾病有關(guān)，如癌癥和炎癥性疾病。它們和其抑制劑(如金屬蛋白酶組織抑制劑)具有很大的醫(yī)學(xué)價(jià)值，臨床試驗(yàn)結(jié)果既讓人樂(lè)觀，又讓人失望。利用金屬蛋白酶的合成抑制劑來(lái)抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移為人類(lèi)戰(zhàn)勝癌癥展現(xiàn)了巨大的希望，但尚未發(fā)揮其潛力。

鋅金屬蛋白酶超家族包含大多數(shù)已知的金屬內(nèi)切蛋白酶(在蛋白質(zhì)底物內(nèi)部裂解肽鍵的含鋅酶)。該超家族由六個(gè)相關(guān)的進(jìn)化家族組成：解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinases，ADAMs)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、妊娠相關(guān)血漿蛋白酶、沙雷菌蛋白酶、利什曼原蟲(chóng)表面蛋白酶(leishmanolysins) 和龍蝦肽酶。這些酶家族中的每一個(gè)家族都有多個(gè)單獨(dú)的酶，并且在發(fā)現(xiàn)和生理功能上都有極具吸引力的故事。有趣的是，不同家族的蛋白酶結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列上具有相對(duì)較低的相似度。然而，所有的催化結(jié)構(gòu)域都具有驚人相似的三維結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)有一個(gè)保守的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域[HEXHXX(G/N)XX(H/D)]以及一個(gè)保守的甲硫氨酸轉(zhuǎn)角(Metturn)。下面將重點(diǎn)討論龍蝦肽酶家族，特別是該家族的穿膜肽酶。

龍蝦肽酶家族是20 世紀(jì)80 年代和90 年代進(jìn)行大量克隆和測(cè)序的結(jié)果。通過(guò)序列相似性鑒定，該家族最初的成員包括：龍蝦肽酶，來(lái)自人骨的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1(bone morphogenetic protein-1，BMP-1)，來(lái)自小鼠腎臟和人類(lèi)腸道的穿膜肽酶，來(lái)自非洲爪蟾胚胎部分序列的UVS.2 (uterine-egg viteline envelope soluble)。之所以命名為“龍蝦肽酶家族”，是因?yàn)閵W斯塔歐洲螯蝦(Astacus astacus) 的龍蝦肽酶是該家族中第一個(gè)被測(cè)序和描述的酶。龍蝦肽酶存在于動(dòng)物和細(xì)菌中，目前還沒(méi)有在植物和真菌中發(fā)現(xiàn)。隨著對(duì)許多物種的基因組測(cè)序，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種的龍蝦肽酶。在人類(lèi)和小鼠的基因組中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)龍蝦肽酶家族基因，其中包括2 個(gè)穿膜肽酶基因、3 個(gè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1(bone morphogenetic protein-1，BMP-1)/tolloid 樣基因和1 個(gè)ovastacin 基因。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中，分別發(fā)現(xiàn)了16 種和40 種龍蝦肽酶。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中，大多數(shù)龍蝦肽酶基因的功能尚未確定，但在寄生線(xiàn)蟲(chóng)中，龍蝦肽酶參與蛋白質(zhì)在細(xì)胞外基質(zhì)中的移動(dòng)，在水螅中參與頭部再生。

在已描述的龍蝦肽酶中，螯蝦的龍蝦肽酶分子量最小，含有一個(gè)200 個(gè)氨基酸殘基的催化結(jié)構(gòu)域。從cDNA 測(cè)序中得知，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中有一個(gè)前原(prepro) 序列被切割。到目前為止，在所有測(cè)序的龍蝦肽酶家族成員中都發(fā)現(xiàn)了前(pre) 序列或信號(hào)序列，估計(jì)是為了引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌途徑。原序列(pro sequence)作為一種調(diào)節(jié)機(jī)制，能使酶失去活性。活性螯蝦蛋白只含有一個(gè)約20 kDa的催化結(jié)構(gòu)域，而大多數(shù)龍蝦肽酶家族成員含有一個(gè)或多個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域，位于蛋白酶結(jié)構(gòu)域的C 端。許多含有一個(gè)或多個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)樣結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)CUB(補(bǔ)體亞組分Clr/Cls、胚胎海膽蛋白UEGF、BMP-1)結(jié)構(gòu)域。這些對(duì)蛋白與蛋白或蛋白與底物之間的相互作用很重要。非催化結(jié)構(gòu)域是造成家族成員大小不一的原因，大小從200 個(gè)氨基酸(小龍蝦龍蝦肽酶)到900 個(gè)氨基酸(小鼠BMP-1) 不等。此外，許多更復(fù)雜的龍蝦肽酶是高度糖基化的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步提高了分子質(zhì)量和復(fù)雜性。

龍蝦肽酶家族成員——穿膜肽酶是一類(lèi)獨(dú)特的寡聚金屬蛋白酶，包含兩個(gè)進(jìn)化上相關(guān)的α和β 亞基的同源和異源寡聚體。它們體現(xiàn)了鋅金屬蛋白酶超家族成員的復(fù)雜性。

穿膜肽酶發(fā)現(xiàn)于1980 年，是在糖尿病小鼠中尋找蛋白酶的結(jié)果。在由鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病BALB/c 小鼠中尋找蛋白酶活性和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)變化的過(guò)程中，使用各種底物測(cè)量了肝臟、腎臟和肌肉組織中的蛋白酶活性。與對(duì)照組小鼠相比，在糖尿病小鼠組織中測(cè)量的肝臟降解率或蛋白酶活性沒(méi)有發(fā)現(xiàn)根本變化。然而，研究發(fā)現(xiàn)，在堿性條件(pH9) 下，以偶氮酪蛋白(azocasein)為底物時(shí)，這些小鼠的腎臟具有相對(duì)高的活性。然后，從BALB/c 小鼠腎臟中純化了這種酶，發(fā)現(xiàn)它是一種糖基化的膜結(jié)合金屬蛋白酶，α亞基分子質(zhì)量為85 kDa～90 kDa。該亞基形成二硫鍵二聚體，二聚體形成320 kDa 的四聚體。Sterchi 等(1982) 報(bào)道了人體中與小鼠穿膜肽酶相當(dāng)?shù)囊环N名為對(duì)氨基苯甲酸(para aminobenzoic acid，PABA) 肽酶(以水解底物命名)的腸道酶，但這兩種酶之間的相似性直到它們被克隆和測(cè)序后才被發(fā)現(xiàn)。

1983 年，BALB/c 小鼠有一段時(shí)間無(wú)法使用，筆者實(shí)驗(yàn)室從另外兩個(gè)近交系C3H/He 小鼠和CBA 小鼠中收集腎臟。與BALB/c 小鼠相比，這些小鼠腎臟中的偶氮酪蛋白酶(azocaseinase)活性非常低。因此，Beynon(1983) 撰寫(xiě)了一篇闡述多種C 系小鼠缺陷的論文。梅奧醫(yī)學(xué)中心的小鼠免疫遺傳學(xué)家Chella David 注意到了該論文，他告訴筆者，許多C 系小鼠是為移植研究培育的，在主要組織相容性復(fù)合體基因上存在差異。這些觀察結(jié)果促使相關(guān)研究人員開(kāi)展合作，并發(fā)現(xiàn)小鼠17 號(hào)染色體上靠近主要組織相容性復(fù)合體的一個(gè)基因(Mep-1a)能夠調(diào)控小鼠腎臟中穿膜肽酶活性的表達(dá)水平。現(xiàn)在已知，Mep-1a 可編碼穿膜肽酶的α 亞基。對(duì)缺陷型或穿膜肽酶低活性小鼠品系的進(jìn)一步研究顯示，它們表達(dá)的是含有β 亞基的穿膜肽酶的潛伏形式。穿膜肽酶的β 亞基與α 亞基在催化結(jié)構(gòu)域上具有58%的相似性，并由小鼠18 號(hào)染色體編碼，這是一個(gè)由單一基因分化進(jìn)化的例子。對(duì)不同品系小鼠的穿膜肽酶α 亞基和β 亞基的研究發(fā)現(xiàn)，穿膜肽酶α 亞基與β 亞基在小鼠腎臟中有幾種不同的組合，形成穿膜肽酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)，以及穿膜肽酶的A 和B 異構(gòu)體，分別為EC 3.4.24.63和EC 3.4.24.18。尚不清楚造成一些近交系小鼠成年后缺乏穿膜肽酶α 亞基表達(dá)的原因，但已知這受進(jìn)化的調(diào)控，因?yàn)樗行∈笃废翟谂咛テ诤颓啻浩谇澳I臟都能表達(dá)穿膜肽酶α 亞基和β 亞基。

20 世紀(jì)80 年代對(duì)穿膜肽酶的研究是利用從成年小鼠腎臟刷狀緣膜中分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行的。在偶氮酪蛋白酶活性高的小鼠體內(nèi)，穿膜肽酶含有α 和β 亞基，而在該酶活性低的小鼠(缺陷型品系) 體內(nèi)，穿膜肽酶只含有β 亞基。這種小鼠的穿膜肽酶α 亞基在質(zhì)膜上是有活性的，而β 亞基主要是潛伏的，但可以被類(lèi)胰蛋白酶激活。對(duì)穿膜肽酶α 亞基激活的研究表明，去除原序列可以形成包括兩個(gè)N 端殘基的氫鍵，這對(duì)酶的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。隨著20 世紀(jì)80 年代和90 年代分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是克隆、測(cè)序和定向誘變等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)穿膜肽酶α 亞基結(jié)構(gòu)和功能的研究取得了快速的發(fā)展。

穿膜肽酶異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，具有多域、多聚體結(jié)構(gòu)。寡聚體由穿膜肽酶α 亞基和/ 或β 亞基的二硫鍵連接的二聚體組成，這些二聚體可能會(huì)自聯(lián)，形成分子質(zhì)量更大的異構(gòu)體。同源穿膜肽酶A 只含有α 亞基，異源穿膜肽酶A 含有α 亞基和β 亞基，而同源穿膜肽酶B 只含有β 亞基。兩個(gè)亞基都是糖基化的，天冬酰胺連接糖對(duì)二硫鍵的形成、低聚反應(yīng)、穩(wěn)定性、分泌和酶活性很重要。至于結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，兩個(gè)亞基都含有一個(gè)信號(hào)序列、原序列、蛋白酶(催化) 結(jié)構(gòu)域、甲基偶氮甲醇(methylazomethanol，MAM) 結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF)結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C 端小尾巴(6～26個(gè)氨基酸)。非催化結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍酌傅倪\(yùn)輸、結(jié)構(gòu)和活性很重要。α 亞基和β 亞基結(jié)構(gòu)域的一個(gè)明顯區(qū)別是，穿膜肽酶α 亞基在EGF 樣結(jié)構(gòu)域和TRAF 結(jié)構(gòu)域之間含有一個(gè)I(插入的) 結(jié)構(gòu)域，而β 亞基沒(méi)有。在分泌途徑的成熟過(guò)程中，I 結(jié)構(gòu)域內(nèi)有一個(gè)蛋白酶切，導(dǎo)致該亞基從膜上釋放出來(lái)。通過(guò)定點(diǎn)誘變將I 結(jié)構(gòu)域從穿膜肽酶α 亞基中移除，結(jié)果顯示I 結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)水解和亞基從膜上釋放是必要和充分的。因此，只含有穿膜肽酶α 亞基的穿膜肽酶異構(gòu)體被分泌到細(xì)胞外。二硫鍵連接穿膜肽酶α 亞基二聚體往往會(huì)以非共價(jià)鍵結(jié)合成1 MDa～6 MDa的高分子質(zhì)量復(fù)合物，其是生物系統(tǒng)中分泌的最大的蛋白酶復(fù)合物之一。這種自聯(lián)作用使單體穿膜肽酶A 集中在細(xì)胞外環(huán)境中，并且可能對(duì)穩(wěn)定性和作用很重要，特別是在感染部位和腸道的惡劣環(huán)境中。與細(xì)胞膜相關(guān)的穿膜肽酶都含有穿膜肽酶β 亞基，可能由穿膜肽酶β 亞基二硫鍵連接二聚體、形成四聚體的穿膜肽酶α 亞基/β亞基二聚體或與穿膜肽酶α 亞基二聚體非共價(jià)結(jié)合的穿膜肽酶α 亞基/β 亞基二聚體組成。對(duì)穿膜肽酶β 亞基二聚體的交聯(lián)研究揭示了蛋白質(zhì)內(nèi)有一個(gè)域間和域內(nèi)接觸的緊湊結(jié)構(gòu)，包括TRAF-TRAF 相互作用。人類(lèi)穿膜肽酶B 的X 射線(xiàn)結(jié)構(gòu)顯示，活性位點(diǎn)靠近膜，這對(duì)該亞型的脫落活性有影響。

穿膜肽酶在腎臟和腸道刷狀緣膜上的定位最初是通過(guò)細(xì)胞分級(jí)分離研究和隨后的免疫組織化學(xué)研究推斷出來(lái)的。穿膜肽酶也在白細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)這些細(xì)胞的研究表明，在敲除穿膜肽酶β 亞基基因的小鼠中，這些細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的能力減弱。穿膜肽酶在單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中的表達(dá)，會(huì)影響這些細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。人類(lèi)穿膜肽酶α 亞基和β 亞基在表皮的不同層中表達(dá)，并參與細(xì)胞增殖和人類(lèi)皮膚細(xì)胞的終末分化。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺、睪丸、胎兒肝臟、胚胎干細(xì)胞和腦組織中都檢測(cè)到了穿膜肽酶亞基的mRNA，其中表達(dá)水平最高的是腎臟和腸。因此，研究人員主要在這些組織中研究穿膜肽酶的生理功能。通過(guò)構(gòu)建基因敲除小鼠，同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行挑戰(zhàn)，研究已經(jīng)收集到關(guān)于穿膜肽酶生理功能的其他見(jiàn)解。

穿膜肽酶能夠水解各種底物，從肽到蛋白質(zhì)。小鼠穿膜肽酶B 對(duì)裂解部位的酸性殘基有明顯的偏好。相比之下，同源穿膜肽酶A 更喜歡裂解含有小的或疏水氨基酸殘基的鍵。這些偏好導(dǎo)致肽底物的水解作用存在明顯差異。例如，穿膜肽酶B 可以裂解促胃液素和骨橋蛋白，但穿膜肽酶A不能,穿膜肽酶A 可以裂解緩激肽和P 物質(zhì)，但穿膜肽酶B 不能。穿膜肽酶B 還可以裂解細(xì)胞表面蛋白，如E-鈣黏蛋白和上皮細(xì)胞鈉通道，從而影響細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用和離子運(yùn)輸。穿膜肽酶A 可裂解緊密連接蛋白——閉合蛋白，這會(huì)損害上皮屏障功能，增強(qiáng)單核細(xì)胞遷移。穿膜肽酶異構(gòu)體對(duì)細(xì)胞因子的激活和降解也有不同的偏好，穿膜肽酶異構(gòu)體的平衡可能對(duì)細(xì)胞因子譜和炎癥反應(yīng)進(jìn)程有重要影響。在尋找人類(lèi)穿膜肽酶的底物時(shí)，高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多底物以及穿膜肽酶與ADAMs 之間有趣的聯(lián)系。

充分的證據(jù)表明，穿膜肽酶與一些疾病有關(guān)，這將是未來(lái)需要探索的領(lǐng)域，并有望治愈這些疾病。例如，穿膜肽酶存在于炎癥部位，會(huì)影響白細(xì)胞的遷移，降解緊密連接蛋白，并激活/降解細(xì)胞因子。利用穿膜肽酶α 基因敲除小鼠進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，在腸道疾病模型中，穿膜肽酶α 亞基表達(dá)減少增加了腸道的炎癥反應(yīng)。此外，人類(lèi)甲基多巴α 亞基基因是炎癥性腸病，特別是潰瘍性結(jié)腸炎的易感基因。穿膜肽酶還會(huì)影響小鼠尿路感染進(jìn)程。對(duì)小鼠的其他研究表明，穿膜肽酶與腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，人類(lèi)甲基多巴β 亞基基因的多態(tài)性與比馬印第安人的糖尿病腎病有關(guān)。穿膜肽酶在各種癌(如結(jié)腸癌和乳腺癌)細(xì)胞中都有表達(dá)，研究認(rèn)為其在腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移中起著一定的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，穿膜肽酶在體內(nèi)能裂解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)，這意味著其在神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥的發(fā)生上起著一定的作用。最近對(duì)穿膜肽酶與腸道中黏蛋白相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，它在保護(hù)宿主上皮細(xì)胞免受細(xì)菌侵害和影響腸道菌群組成方面發(fā)揮著一定的作用。

4 小結(jié)

未來(lái)的挑戰(zhàn)之一是了解蛋白酶在生物體內(nèi)的功能，并能在特定組織中選擇性地激活和抑制它們。蛋白酶存在于其他分子和蛋白酶的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中，存在于細(xì)胞間、細(xì)胞膜和細(xì)胞外環(huán)境中，這些環(huán)境無(wú)疑在測(cè)定其功能上至關(guān)重要。大系統(tǒng)理論，如結(jié)合運(yùn)用遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)鑒定底物和活性蛋白酶的降解組學(xué)，將是了解和調(diào)控蛋白酶系統(tǒng)所必需的。Herb Tabor為JBC 打下了基礎(chǔ)，研究從單種酶的鑒定和特性描述進(jìn)入了復(fù)雜的多組分系統(tǒng)，以闡明蛋白酶在生命結(jié)構(gòu)中的作用。

(續(xù)完)