甲殼素季銨鹽作為新型液相色譜固定相的研究

單緒才，石 杰，胡曉薇，陳 銳，雷福厚，李國祥*

(1.湖北民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.仙桃市愛國衛(wèi)生運(yùn)動(dòng)委員會(huì)辦公室,湖北 仙桃 433005;3.廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,南寧 530006；4.廣西民族大學(xué) 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530006)

高效液相色譜法是經(jīng)典的色譜方法之一，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、分析速度快且適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2].色譜固定相是色譜技術(shù)發(fā)展最核心的部分，因此開發(fā)選擇性高、分離效果好的新材料作為液相色譜固定相意義重大.以纖維素和直鏈淀粉為代表的天然多糖作為液相色譜固定相，在手性分離領(lǐng)域已顯示出了獨(dú)特的魅力[3].甲殼素是N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖單元通過β-1,4糖苷鍵鏈接而成的線性高分子，是一種來源豐富的天然堿性多糖，具有優(yōu)異的生物相容性和可降解特性.但由于甲殼素分子間和分子內(nèi)存在豐富的氫鍵，使得常見溶劑較難溶解甲殼素，而限制了該生物質(zhì)資源的廣泛應(yīng)用[4-6].通過化學(xué)方法將功能基團(tuán)引入甲殼素分子，改善甲殼素的溶解性，從而使其更易成型加工是充分利用甲殼素資源的新途徑.其中，醚化改性是甲殼素化學(xué)改性的重要方法之一[7-9].甲殼素醚類衍生物具有易絮凝、抑菌、成膜性好等特性，特別是其分子骨架上擁有豐富的手性碳，因此成為一種有潛在應(yīng)用前景的手性分離材料[10].在前期工作中，本研究小組已經(jīng)成功合成了甲殼素季銨鹽，并首次將其作為液相色譜手性固定相應(yīng)用于四氫萘胺外消旋體的分離[11].

近年來，一些位置異構(gòu)體，如溴硝基苯、硝基苯胺和二硝基苯等通過手性固定相得到了較好的分離[12].鄰甲苯胺及其位置異構(gòu)體可作為染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥等制品的中間體；然而它們均具有一定毒性，比如鄰甲苯胺可經(jīng)皮膚接觸在人體內(nèi)生成高鐵血紅蛋白，長期低濃度接觸會(huì)引發(fā)中毒性肝炎、化學(xué)性膀胱炎等，因此已被世界衛(wèi)生組織納入一類致癌物質(zhì)名錄[13].鄰甲苯胺及其異構(gòu)體常用的分離手段是采用氣相色譜—質(zhì)譜法[14].但由于鄰甲苯胺及其位置異構(gòu)體的沸點(diǎn)接近，且分子極性差別小，當(dāng)采用常用方法檢測(cè)時(shí)常出現(xiàn)假陽性結(jié)果.此外，有研究顯示一些手性固定相對(duì)單環(huán)、稠環(huán)類芳香烴化合物表現(xiàn)出了較好的拆分能力[15].受相關(guān)文獻(xiàn)啟發(fā)，本小組嘗試將甲殼素季銨鹽作為液相色譜固定相，進(jìn)一步探討其對(duì)甲苯胺位置異構(gòu)體、芳香烴類化合物的色譜分離性能，從而為該類新型液相色譜固定相的廣泛應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù).

圖1 甲殼素季銨鹽的合成Fig.1 Synthesis of quaternized chitin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

儀器包括高效液相色譜儀(大連依利特有限公司，Agress 1100)、紫外-可見波長檢測(cè)器(大連依利特，D1100)、色譜數(shù)據(jù)工作站(大連依利特，Elitapex)、液相色譜裝柱機(jī)(北京海德利森科技有限公司)、不銹鋼色譜空柱(南京茂甘儀器科技有限公司，250 mm×4.6 mm).試劑包括甲殼素原料(山東金湖甲殼素有限公司，工業(yè)級(jí))、2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(百靈威科技有限公司)、球形硅膠(青島美高化工有限公司，粒徑5 μm)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司).鄰甲苯胺、對(duì)甲苯胺、間甲苯胺均購于阿拉丁試劑公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 甲殼素季銨鹽液相色譜固定相

甲殼素季銨鹽按文獻(xiàn)方法制備[8,11]，合成路線如圖1所示.首先配制NaOH和尿素質(zhì)量濃度分別為8%和4%的水溶液，將2 g甲殼素溶于100 mL該溶液中得到約2%的甲殼素溶液.接著，將該溶液攪拌稀釋后與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性.最后待樣品經(jīng)透析7 d、抽濾、濃縮、冷凍干燥環(huán)節(jié)處理后，即得到甲殼素季銨鹽樣品.采用類似方法，改變甲殼素與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)的物質(zhì)的量之比，可獲得不同取代度的甲殼素季銨鹽，記為QC1、QC2、QC3、QC4，其取代度分別為0.45、0.69、0.81與0.89；改變甲殼素的分子量，得到不同分子量的甲殼素季銨鹽，記為QC5、QC6、QC7、QC8，其重均分子量分別為2.84×105、2.29×105、1.22×105、0.97×105.然后將甲殼素季銨鹽QC1～QC8分別涂敷于氨丙基硅膠表面，制成甲殼素季銨鹽手性固定相(chiral stationary phase,CSP)，依次將其命名為CSP1、CSP2、CSP3、CSP4、CSP5、CSP6、CSP7、CSP8.采用濕法裝柱，取涂敷硅膠4 g，用液體石蠟、正己烷/異丙醇制備成約15 mL勻漿液，在40 MPa壓力下裝柱，得到8根液相色譜柱.

1.3 液相色譜實(shí)驗(yàn)條件

采用體積比為90∶10的正己烷/異丙醇作流動(dòng)相，選擇0.5 mL/min的流速，254 nm的檢測(cè)波長，柱溫設(shè)為25 ℃，流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔膜過濾后超聲脫氣，樣品用流動(dòng)相配制并用0.45 μm微孔膜過濾.以鄰甲苯胺、對(duì)甲苯胺、間甲苯胺，以及苯、萘、蒽作為2組分析樣品，考察甲殼素季銨鹽固定相對(duì)甲苯胺位置異構(gòu)體和芳香烴類化合物的分離性能.通過保留時(shí)間，計(jì)算分離度：

Rs=2(t2-t1)/(W1+W2)，

其中，t1和t2分別是分離組分1、2的保留時(shí)間，W1和W2是分離組分的峰寬[1].色譜柱死時(shí)間t0用1,3,5-三叔丁基苯測(cè)定，理論塔板數(shù)N以苯作為溶質(zhì)測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 甲殼素季銨鹽固定相對(duì)甲苯胺位置異構(gòu)體的分離

為了考察甲殼素季銨鹽固定相對(duì)位置異構(gòu)體的分離性能，本實(shí)驗(yàn)選擇鄰甲苯胺、對(duì)甲苯胺、間甲苯胺3種位置異構(gòu)體為1組樣品分子.甲苯胺位置異構(gòu)體在CSP3、CSP4、CSP8固定相上的色譜圖如圖2所示.將制備的系列甲殼素季銨鹽作為固定相分別對(duì)3種甲苯胺位置異構(gòu)體進(jìn)行拆分，結(jié)果如表1所示.由圖2、表1可知，所有固定相對(duì)甲苯胺異構(gòu)體均表現(xiàn)出了一定的拆分能力.

首先，鄰甲苯胺和其他2種異構(gòu)體在所有甲殼素季銨鹽固定相上都達(dá)到完全基線分離，平均分離度為3.27，最大分離度達(dá)到4.91.較高的分離度表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，甲殼素季銨鹽液相色譜固定相能高效拆分鄰甲苯胺和它的2種(對(duì)，間)甲苯胺異構(gòu)體.

其次，研究對(duì)甲苯胺和間甲苯胺在使用不同取代度的甲殼素季銨鹽固定相情況下的拆分特性.在取代度較高的CSP3、CSP4固定相上，對(duì)甲苯胺和間甲苯胺均可得到拆分，且當(dāng)取代度為0.81時(shí)，最大分離度Rs(對(duì)，間)為0.48；而在取代度相對(duì)較小的CSP1、CSP2固定相上，對(duì)甲苯胺和間甲苯胺均沒有得到拆分(表1).這說明甲殼素分子結(jié)構(gòu)上的季銨基團(tuán)扮演著重要角色；這可能是因?yàn)楦呷〈募讱に丶句@鹽分子中季銨基團(tuán)相對(duì)較多，與甲苯胺位置異構(gòu)體中的氨基有著更強(qiáng)的相互作用.

再次，在同樣實(shí)驗(yàn)條件下研究了對(duì)甲苯胺和間甲苯胺在使用不同分子量的甲殼素季銨鹽固定相情況下的拆分特性.在分子量較大的CSP5、CSP6、CSP7固定相上，對(duì)甲苯胺和間甲苯胺均沒有得到拆分；而在分子量相對(duì)較小的CSP8固定相上，對(duì)甲苯胺和間甲苯胺得到拆分，分離度Rs(對(duì)，間)為0.33(表1).這說明甲殼素季銨鹽的分子量對(duì)甲苯胺這2種異構(gòu)體的分離同樣有著重要影響；這可能是因?yàn)榉肿恿枯^低的甲殼素季銨鹽分子鏈柔順性減弱、剛性增強(qiáng)，涂敷過程中分子鏈不易發(fā)生纏繞和團(tuán)聚，能均勻分布于硅膠表面，從而使得在流動(dòng)相的作用下不同結(jié)構(gòu)的甲苯胺分子與季銨基團(tuán)的相互作用更為充分，因此拆分性能較好[3].

綜上所述，對(duì)甲殼素季銨鹽固定相來說，較小的分子量和較高的取代度更有助于甲苯胺位置異構(gòu)體的拆分.

(a) 甲殼素季銨鹽固定相CSP3(b) 甲殼素季銨鹽固定相CSP4(c) 甲殼素季銨鹽固定相CSP8圖2 甲殼素季銨鹽固定相CSP3、CSP4、CSP8對(duì)鄰甲苯胺(o)、對(duì)甲苯胺(p)、間甲苯胺(m)異構(gòu)體的分離譜圖Fig.2 Chromatograms of toluene position isomers(o-toluidine，p-toluidine and m-toluidine) on quaternized chitin stationary phases (CSP3,CSP4 and CSP8)

2.2 甲殼素季銨鹽固定相對(duì)芳香烴類化合物苯、萘、蒽的分離

為了考察甲殼素季銨鹽固定相對(duì)芳香烴類化合物的分離性能，本實(shí)驗(yàn)選擇苯、萘、蒽為1組樣品分子.苯、萘、蒽在CSP4、CSP7、CSP8固定相上的色譜圖如圖3所示.將系列甲殼素季銨鹽固定相分別對(duì)苯、萘、蒽3種芳烴進(jìn)行拆分，結(jié)果也列于表1.由圖3、表1可知，除了CSP5以外，所有甲殼素季銨鹽固定相對(duì)苯、萘、蒽的混合物均表現(xiàn)出了較好的拆分性能，被分離組分通過CSP3、CSP4、CSP7、CSP8這4種固定相達(dá)到完全基線分離.

表1 甲苯胺位置異構(gòu)體及芳香烴類化合物苯、萘、蒽在8根甲殼素季銨鹽色譜柱上的分離度Tab.1 Resolution of toluidine isomers,benzene,naphthalene and anthracene on the eight quaternized chitin columns

對(duì)不同取代度的CSP1～CSP4固定相，被分離組分的分離度總體上隨著甲殼素季銨鹽取代度的增加而增大，最大分離度Rs(苯，萘)和Rs(萘，蒽)分別為1.28和1.44(表1)；這表明對(duì)于苯、萘、蒽組分的拆分，甲殼素分子結(jié)構(gòu)中的季銨基團(tuán)同樣扮演著重要角色.這可能是因?yàn)樵诜枷銦N類化合物的分離過程中除了苯環(huán)的空間效應(yīng)外，季銨基團(tuán)和苯環(huán)的電子效應(yīng)也起著一定的作用.

對(duì)不同分子量的CSP5～CSP8固定相，被分離組分的分離度總體上隨著甲殼素季銨鹽分子量的增加而呈現(xiàn)先增大再降低的趨勢(shì)，最大分離度Rs(苯，萘)和Rs(萘，蒽)分別為1.29和1.33(表1)；這同樣說明甲殼素季銨鹽分子量大小對(duì)苯、萘、蒽芳香烴的分離也有著重要影響.這可能是因?yàn)榉肿恿枯^小的甲殼素季銨鹽分子更有利于季銨基團(tuán)與被分離組分間的相互作用，從而達(dá)到分離的目的.

(a) 甲殼素季銨鹽固定相CSP4 (b) 甲殼素季銨鹽固定相CSP7 (c) 甲殼素季銨鹽固定相CSP8圖3 甲殼素季銨鹽固定相CSP4、CSP7、CSP8對(duì)苯(α)、萘(β)、蒽(γ)的分離譜圖Fig.3 Chromatograms of benzene (α),naphthalene (β) and anthracene (γ) on quaternized chitin stationary phase (CSP4,CSP7 and CSP8)

3 結(jié)論

以系列甲殼素季銨鹽為液相色譜固定相，分別以3種甲苯胺位置異構(gòu)體和3種芳香烴類化合物為樣品分子，考察了甲殼素季銨鹽固定相對(duì)這2類樣品的分離性能.研究發(fā)現(xiàn)甲殼素季銨鹽新型液相色譜固定相對(duì)這2類樣品分子均有明顯的分離能力，且拆分效果和甲殼素季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān).其中，甲殼素季銨鹽分子鏈中的季銨基團(tuán)扮演著重要角色；此外，分子量也有著重要影響.本研究為設(shè)計(jì)和構(gòu)筑甲殼素新材料作為新型液相色譜固定相提供了新的思路，拓展了甲殼素可再生資源在色譜分離領(lǐng)域中的應(yīng)用.