雄黃抑制食管癌細胞增殖、侵襲并誘導細胞鐵死亡

陳發(fā)章，王 君，徐海珍，郭占芳，楊如意

(青海大學1.醫(yī)學院、2附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合科，青海 西寧 810001)

食管癌(esophageal cancer，EC)是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全世界每年約有57萬新發(fā)病例及50萬死亡病例[1]。EC的發(fā)病具有明顯的地域性，統(tǒng)計顯示，歐洲、美洲和大洋洲的EC發(fā)病率相對較低，而非洲和亞洲的EC發(fā)病率較高，中國EC發(fā)病率是全球最高的國家之一，也存在明顯的地域差異，多發(fā)于農(nóng)村、山區(qū)等貧困地區(qū)[2]。盡管食道切除、放射治療、化療和分子靶向藥物等治療方法取得了巨大進展，但其5年生存率仍不到20%[3]。因此，尋找新的治療藥物勢在必行。

雄黃(realgar，REA)分子式為As2S2或As4S4，是一種含有砷化合物的中藥，其在中醫(yī)中被廣泛應用已有多年的歷史[4]。研究表明，REA具有鎮(zhèn)痛、消炎、提高免疫力等作用，且對多種血液系統(tǒng)腫瘤、胃癌、宮頸癌、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌等具有抑制腫瘤生長，促進凋亡的作用[5]。最新研究證實，雄黃納米顆粒通過抑制基質金屬蛋白酶MMP-2、9表達和血管生成，在小鼠乳腺癌移植瘤中抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲[6]。這些研究證明，REA是一種潛在的抗腫瘤藥物，對腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制效果。然而，REA對EC的干預效果尚未完全清晰。

研究表明，在一些癌細胞中存在一種鐵依賴的細胞死亡形式，稱為鐵死亡，與細胞壞死和凋亡不同，鐵死亡是亞鐵與脂質過氧化反應引起的，抑制谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)的防御蛋白可能選擇性地激活鐵死亡[7]。GPX4通過減少磷脂過氧化氫抑制脂質過氧化，在抑制鐵死亡方面發(fā)揮重要作用，此外，GPX4對于腫瘤復發(fā)也是必需的[8]。當發(fā)生鐵死亡時，線粒體減少，伴隨著雙層膜密度的增加和結構完整性的喪失，線粒體跨膜電位降低，氧化磷酸化降低[9]。為臨床利用鐵死亡方式治療腫瘤提供了理論依據(jù)。然而，鐵死亡在惡性腫瘤治療中的有效程度還遠未可知。因此，本研究擬通過體外實驗研究雄黃對EC鐵死亡的影響，為其應用于臨床治療EC提供理論依據(jù)和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株人食管癌細胞系Eca109、KYSE150細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器雄黃干粉(編號SA4101)購自湖北諾納科技有限公司；CCK-8試劑盒(批號BS350A)購自上海Biosharp公司；結晶紫(批號C8470)購自北京索萊寶科技有限公司；基底膠(Matrigel，批號356234)購自美國Corning；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPXS)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批號分別為ZC-32524、ZC-32619、ZC-33229、ZC-33141)購自上海茁彩生物科技有限公司；GPX4兔克隆抗體、E-cadherin兔克隆抗體、Slug兔克隆抗體、N-cadherin兔克隆抗體、β-actin兔克隆抗體(批號分別為A13309、A3044、A1057、A19083、AC026)購自武漢abclonal；生物素化山羊抗兔IgG(批號ab6721)購自英國abcam；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號P0009)購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL發(fā)光試劑盒(批號KF001)購自美國Affinity；酯酸雙氧鈾、枸檬酸鉛(批號分別為GS02624、GZ02616)購自北京中鏡科儀技術有限公司；普魯士藍染色試劑盒(批號M021)購自上海歌凡生物科技有限公司；DMI1型倒置生物顯微鏡(德國LEICA公司)；spectra max PLUS 384型酶標儀(美國Molecular Devices公司)；JY200C型電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；TE22型蛋白質轉膜儀(美國Hoefer公司)；Panthera型數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；JEM-1400FLASH型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)。

1.3 藥品制備磷酸鹽緩沖生理鹽水溶解雄黃干粉，磁力攪拌器攪拌使其充分溶解12 h，后經(jīng)0.2 μm過濾器過濾混懸液，4 ℃儲存?zhèn)溆茫糠謽颖舅屯m州大學化學實驗室測定溶液中砷的濃度，經(jīng)ICP發(fā)射光譜法測定得知溶液中砷的濃度為5.498 mg·L-1。

1.4 細胞培養(yǎng)將細胞株Eca109、KYSE150在RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃，以1 ∶5-1 ∶20的比例傳代，每隔3～5 d傳代1次。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖按100 μL·孔-1將Eca109、KYSE150細胞接種于96孔板中，并于每孔中加入不同濃度的雄黃(0、10、20、40、60、80、100 μmol·L-1)培養(yǎng)24、48、72 h，加入CCK8試劑(10 μL·孔-1)37 ℃孵育2 h，用酶標儀在450 nm下測量各孔的吸光度(A)。細胞抑制率/%=[1-實驗組A/對照組A]×100%。

1.6 克隆形成實驗檢測克隆形成能力按150個·孔-1將對數(shù)生長期Eca109、KYSE150細胞接種于6孔板中，每3 d更換1次培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的雄黃(0、10、20、40、60、80、100 μmol·L-1)培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，結果按平板平均菌落數(shù)計算，設置3個重復。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力按4×103個/孔將ECA109或KYSE150細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分別設置空白組、1/2IC50組、IC50組、2IC50組，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，無菌槍頭進行劃痕，在0和24 h拍攝劃痕區(qū)域的圖像，每組設置3個重復。

1.8 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲ECA109或KYSE150細胞分別設置空白組、1/2IC50組、IC50組、2IC50組。將稀釋(1 ∶5)的基質膠加入Transwell上室中，200 μL細胞懸浮液添加到上室，500 μL含有20% FBS的培養(yǎng)基添加到下室。藥物作用后，將小室置于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng) 24 h，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，每孔選取5個視野在光學顯微鏡下拍照，統(tǒng)計各組遷移細胞數(shù)目。

1.9 免疫熒光染色檢測細胞GPX4、E-cadherin、Slug、N-cadherin表達對數(shù)生長期Eca109、KYSE150細胞以5×104個/孔接種于24孔板，分別設置空白組、1/2IC50組、IC50組、2IC50組，處理24 h，用4%多聚甲醛固定，然后用0.3%的Triton×100對細胞膜進行滲透。用10%牛血清液封閉細胞后，用以下一抗在4 ℃下孵育過夜：抗GPX4、抗E-cadherin、抗Slug、抗N-cadherin。然后將細胞與合適的FITC或TRITC偶聯(lián)的二抗(KLP)在室溫下孵育1 h，未結合的抗體被洗掉，細胞用含有DAPI的固定介質固定于玻片上，倒置熒光顯微鏡拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定GPX4、E-cadherin、Slug、N-cadherin表達水平。

1.10 Western blot檢測細胞E-cadherin、Slug、N-cadherin蛋白表達對數(shù)生長期Eca109、KYSE150細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，分別設置空白組、1/2IC50組、IC50組、2IC50組，處理24 h。細胞用預冷的PBS洗滌兩次，后在4 ℃下3 000 r·min-1離心5 min，用全細胞裂解緩沖液在冰上裂解半小時，然后將裂解液在4 ℃下3 500 r·min-1離心20 min，收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度，用10% SDS-PAGE分離蛋白質樣品，并將其電泳轉移到聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。然后將膜與下列一級抗體在4 ℃下孵育過夜：抗E-cadherin(1 ∶1 000)、抗Slug(1 ∶2 000)、抗N-cadherin(1 ∶2 000)、抗β-actin(1 ∶10 000)。然后加入生物素化山羊抗兔IgG，室溫下孵育1.5 h，洗滌，ECL顯影。采用Image Pro Plus軟件分析各蛋白條帶的灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.11 ELISA檢測細胞內MDA、SOD、GSH、GPXS活性取對數(shù)生長期Eca109、KYSE150細胞，設置分組為空白組、1/2IC50組、IC50組、2IC50組，培養(yǎng)24 h后收集細胞，采用ELISA試劑盒按說明書測定細胞MDA、SOD、GSH、GPXS活性。

1.12 透射電鏡檢測線粒體超微結構ECA109或KYSE150細胞分別設置空白組、1/2IC50組、IC50組、2IC50組，培養(yǎng)24 h，細胞經(jīng)固定、包埋、染色后，用透射電鏡拍攝線粒體形態(tài)。

1.13 普魯士藍染色觀察細胞內鐵顆粒分布取對數(shù)生長期Eca109、KYSE150細胞，設置分組為空白組、1/2IC50組、IC50組、2IC50組，培養(yǎng)24 h后收集細胞，4%多聚甲醛固定，Perl試劑孵育，1%核堅固紅復染3 min，PBS洗去多余核堅固紅后，應用數(shù)碼三目攝像顯微鏡采集圖像，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集圖像的光密度(IOD)和面積(Area)，計算陽性表達面積百分率。

2 結果

2.1 雄黃對食管癌細胞增殖的影響CCK-8檢測結果顯示，隨著雄黃濃度的增加，Eca109、KYSE150細胞增殖減慢，在雄黃濃度相同條件下，隨著時間延長，Eca109、KYSE150細胞抑制率越高(P<0.05)，雄黃作用Eca109、KYSE150細胞的IC50分別為63.683 μmol·L-1、50.344 μmol·L-1?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，Eca109、KYSE150細胞增殖依賴雄黃濃度增高而呈現(xiàn)降低趨勢(P<0.01)，見Fig 1。

Fig 1 Effect of realgar on proliferation of esophageal carcinoma cells

2.2 雄黃對食管癌細胞遷移、侵襲的影響劃痕實驗結果顯示，與空白組相比，雄黃1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組明顯減慢了Eca109、KYSE150細胞平面遷移的能力，24 h時空白組Eca109、KYSE150細胞幾乎完全融合，而1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組Eca109、KYSE150細胞遷移數(shù)明顯減少(P<0.01)。Transwell小室實驗結果顯示，與空白組相比，雄黃1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組明顯降低細胞侵襲數(shù)(P<0.01),見Fig 2。

Fig 2 Effect of realgar on migration and invasion of esophageal carcinoma cells

2.3 雄黃對食管癌細胞上皮間質轉化(EMT)的影響免疫熒光染色結果顯示，與空白組相比，雄黃1/2IC50組、IC50組、2IC50組Eca109細胞N-cadherin、Slug表達明顯降低，E-cadherin表達明顯升高(P<0.01)；雄黃2IC50組KYSE150細胞N-cadherin、Slug蛋白表達明顯降低，E-cadherin蛋白表達明顯升高(P<0.05，F(xiàn)ig 3D、E、F、H)。Western blot檢測結果顯示，與空白組相比，雄黃1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組Eca109、KYSE150細胞N-cadherin、Slug蛋白相對表達量明顯降低，E-cadherin蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05),見Fig 3。

Fig 3 Effect of realgar on epithelial mesenchymal transformation of esophageal carcinoma cells

2.4 雄黃對食管癌細胞鐵死亡的誘導作用透射電鏡觀察結果顯示，與空白組相比，雄黃1/2 IC50組Eca109、KYSE150細胞質內發(fā)生自噬，雄黃IC50組Eca109、KYSE150細胞質內少量線粒體發(fā)生腫脹、自噬，雄黃2 IC50組Eca109、KYSE150細胞胞質內大量線粒體發(fā)生腫脹、自噬，粗面內質網(wǎng)擴張，線粒體嵴變短變少甚至消失。普魯士藍染色結果顯示，空白組無藍染顆粒，雄黃1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組Eca109、KYSE150細胞均能發(fā)現(xiàn)大小各異、多少不等的藍染顆粒，與空白組相比，雄黃IC50組、2 IC50組Eca109、KYSE150細胞鐵陽性表達面積百分率均明顯升高(P<0.05)。免疫熒光染色結果顯示，與空白組相比，雄黃1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組GPX4熒光強度逐漸減弱，且雄黃2 IC50組Eca109、KYSE150細胞GPX4表達明顯降低(P<0.01)。ELISA檢測結果顯示，與空白組相比，雄黃1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組Eca109、KYSE150細胞MDA含量明顯降低，SOD、GSH、GPXS活性明顯升高(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Induction of ferroptosis in esophageal carcinoma cells by realgar

3 討論

目前，EC在治療上仍是一個難題。中醫(yī)認為“邪氣進入”是EC發(fā)展和進展的主要原因，建議采用“毒邪”的治療方法[10]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載雄黃味苦，平，寒，主寒熱，鼠瘺，惡瘡，疽痔，死肌，惡鬼，邪氣，百蟲，腫毒[5]。研究表明納米雄黃能顯著抑制乳腺癌細胞體外遷移、侵襲及體內肺、肝轉移[6]。此外，雄黃通過阻斷腫瘤細胞黏附，降低腫瘤細胞破壞基底膜的能力，從而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[11]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Eca109、KYSE150細胞增殖依賴雄黃濃度增高而呈現(xiàn)降低趨勢，其作用Eca109、KYSE150細胞的IC50分別為63.683、50.344 μmol·L-1，因此，本研究中使用1/2 IC50、IC50、2 IC50作為雄黃處理濃度。研究已表明細胞上皮間質轉化(EMT)是腫瘤轉移的關鍵過程，E-cadherin抑制EMT，Slug促進EMT誘導的細胞遷移，N-cadherin在食管鱗癌組織中高表達，也與腫瘤轉移有關[12]。在本研究中，雄黃2 IC50作用增強了食管癌細胞E-cadherin的表達，降低了細胞N-cadherin、Slug表達，且劃痕實驗和Transwell小室實驗也表明雄黃作用明顯降低了細胞遷移數(shù)和細胞侵襲數(shù)。表明雄黃具有抑制EC細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

細胞死亡是細胞生命過程的終結，該過程對機體的生存和發(fā)展意義重大，誘導腫瘤細胞死亡是癌癥治療的主要策略，鐵死亡是一種鐵依賴性脂質氧化應激引起的非凋亡細胞死亡[13]。鐵死亡的激活可以抑制腫瘤細胞增殖，細胞內鐵水平和脂質過氧化是鐵死亡的基本特征[14]。GPX4作為一種磷脂-過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶，可以抑制腫瘤細胞的鐵死亡，GPX4在肝細胞癌和結腸癌中高表達，且GPX4高表達是彌漫性大B細胞淋巴瘤和肺腺癌的不良預后因素[8，15]。此外，Zhang等[16]研究表明，冬凌草甲素給藥后食管癌TE1細胞中GPX4活性降低，且與冬凌草甲素作用后細胞內Fe2+、脂質過氧化產(chǎn)物、丙二醛(MDA)、細胞內活性氧(ROS)積聚相一致。Shishido等[17]也報道了類似的機制，他們證明GPX4上調是食管鱗狀細胞癌的不良預后因素，5-氨基乙酰丙酸抑制GPX4在腫瘤組織中的過度表達可導致腫瘤體積縮小。本研究結果顯示，雄黃2IC50可導致食管癌細胞GPX4明顯下調，并降低細胞MDA含量，升高SOD、GSH、GPXS含量，雄黃作用后，Eca109、KYSE150細胞胞質內少量線粒體發(fā)生腫脹、自噬及發(fā)現(xiàn)大小各異、多少不等的藍染顆粒。表明雄黃作用后Eca109、KYSE150細胞發(fā)生鐵死亡，可能是一種有前途的治療藥物。此外，有報道[18]稱通過激活血紅素加氧酶1(HMOX1)和抑制GPX4雙重機制可誘導高危神經(jīng)母細胞瘤中的鐵死亡。因此，雄黃作用EC細胞鐵死亡的具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，雄黃可呈現(xiàn)劑量及時間依賴性地抑制Eca109、KYSE150細胞增殖，并抑制細胞遷移和侵襲，誘導細胞鐵死亡，可能是治療食管癌潛在藥物。此外，從鐵死亡方面入手深入抗癌藥物的研發(fā)可能是未來進一步的研究方向。