復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療變應(yīng)性鼻炎的臨床療效及其網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

何俐瑩，陶雪瑩，岑超

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又稱過(guò)敏性鼻炎、變態(tài)反應(yīng)性鼻炎。是一種吸入外界過(guò)敏性抗原而引起的、以鼻癢、打噴嚏、流清涕等為主要癥狀的疾?。?］。AR是兒童極為常見(jiàn)的一種慢性鼻黏膜充血的疾病，鼻癢是本病的重要特征；過(guò)敏發(fā)作期還會(huì)出現(xiàn)眼部過(guò)敏癥狀；呼吸道過(guò)敏嚴(yán)重的病兒還會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏性咳嗽和哮喘［2］。

中醫(yī)將變態(tài)反應(yīng)性鼻炎歸為“鼻鼽”的范圍，鼽，古籍中指鼻塞不通，也指鼻子流清涕，在此取意后者。中醫(yī)認(rèn)為AR多發(fā)于肺、脾、腎三臟的虛弱，其主要包括肺氣虛、脾氣虛、腎陽(yáng)不足等證［3］；而西醫(yī)認(rèn)為AR是個(gè)體接觸過(guò)敏原后由免疫球蛋白-E（IgE）介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，由多種細(xì)胞因子和炎性因子共同參與的鼻黏膜慢性非感染性炎癥。復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏（MNO）是貴州苗族驗(yàn)方，由木芙蓉葉、地榆兩味中藥組成，具有解表通竅，清熱解毒的功效，現(xiàn)代臨床常應(yīng)用于干燥性鼻炎［4］、變應(yīng)性鼻炎［5］、急性鼻炎［6］等多種鼻腔疾?。?］。現(xiàn)代藥理研究表明，復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏可以降低小鼠耳郭腫脹，并且能顯著抑制二甲苯致小鼠耳毛細(xì)血管通透性增高及對(duì)抗醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高，具有良好的抗炎作用。但復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏組方成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，而目前尚無(wú)復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的有效靶點(diǎn)及信號(hào)通路的研究。

本研究分析了重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院采用復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的臨床療效，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為其以后的臨床及基礎(chǔ)研究提供可靠的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院2019年10月至2020年12月確診為AR的病人130例，其中男性68例，女性62例；年齡范圍6～12歲；病程范圍4～12周，按數(shù)字表法將入選的病人分為對(duì)照組和治療組兩組，每組分別65例；兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。病人及其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求

表1 兩組變應(yīng)性鼻炎130例一般資料比較

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《變應(yīng)性鼻炎的診治原則和推薦方案（2004年，蘭州）》［8］，臨床癥狀：①打噴嚏、清水樣涕、鼻塞、鼻癢等癥狀出現(xiàn)2項(xiàng)以上，每天癥狀持續(xù)或累計(jì)1 h以上，可伴有眼癢、流淚和眼紅等眼部癥狀；②體征：常見(jiàn)鼻黏膜蒼白、水腫，鼻腔水樣分泌物；③變應(yīng)原檢測(cè)：至少一種變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)（SPT）和（或）血清特異型IgE陽(yáng)性。

1.3 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)臨床診療指南-耳鼻咽喉疾病分冊(cè)》［9］，本病分為四類證候：①肺氣虛寒證：發(fā)作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多，鼻塞，嗅覺(jué)減退；鼻黏膜色淡、腫脹；語(yǔ)聲低，易患感冒，經(jīng)常咳嗽、咳痰；舌淡紅，苔薄白，脈細(xì)弱。②脾氣虛弱證：發(fā)作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多，鼻塞，嗅覺(jué)減退；鼻黏膜色淡、腫脹；食少，便溏，倦怠乏力；舌淡紅或胖，邊有齒痕，苔薄白，脈細(xì)弱。③腎陽(yáng)不足：發(fā)作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多，鼻塞，嗅覺(jué)減退；鼻黏膜蒼白、腫脹；畏寒，肢冷，腰膝酸軟；舌淡，苔白，脈沉細(xì)。④肺經(jīng)伏熱證：發(fā)作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多或?yàn)轲こ硖?，鼻塞，嗅覺(jué)減退；鼻黏膜偏紅、腫脹；口干；舌紅，苔薄白或薄黃，脈數(shù)。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合變態(tài)反應(yīng)性鼻炎中∕西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②至少有2個(gè)主要癥狀；③2周內(nèi)未接受抗過(guò)敏藥或免疫調(diào)節(jié)藥物。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)①非變態(tài)反應(yīng)性鼻炎；②患上、下呼吸道感染，及其他鼻部疾??；③近1個(gè)月用過(guò)腎上腺糖皮質(zhì)激素，或2周內(nèi)進(jìn)行過(guò)變應(yīng)性鼻炎治療；④正在使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和（或）系統(tǒng)使用咪唑類抗真菌藥者。

1.6 退出（脫落）標(biāo)準(zhǔn)①對(duì)復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏出現(xiàn)或疑似過(guò)敏反應(yīng)或嚴(yán)重不良事件；②治療過(guò)程中，出現(xiàn)其他情況不宜繼續(xù)使用；③病人依從性差，未遵醫(yī)囑用藥者，或自動(dòng)中途換藥者；

1.7 治療方法對(duì)照組采用丙酸氟替卡松鼻噴霧劑（葛蘭素史克集團(tuán)公司，輔舒良50 μg×120噴）治療，觀察組采用復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏（貴州良濟(jì)藥業(yè)有限公司），早晚各1次，取長(zhǎng)約1 cm涂于鼻腔內(nèi)，治療療程4周。

1.8 觀察指標(biāo)觀察對(duì)比病人用藥前后尿中白三烯E4（LTE4）以及血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-6、IL-12等炎性因子水平。

1.9 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)癥狀記分評(píng)定療效。觀察病人用藥前后的主要癥狀變化情況：①鼻塞：主要以口呼吸為4分；需用口輔助呼吸為3分；用鼻子勉強(qiáng)自主呼吸為2或1分。②鼻癢：無(wú)法忍受為4分；持續(xù)性鼻癢可耐受為3分；間歇性鼻癢可耐受為2分；偶有鼻癢為1分。③打噴嚏：1次連打噴嚏個(gè)數(shù)≥11個(gè)為4分；6～10個(gè)為3分；3～5個(gè)為2分，1～2個(gè)為1分。④流涕：每日流涕次數(shù)≥10次為4分；5～9次為3分；≤4次為1～2分。⑤眼癢流淚：持續(xù)眼癢流淚為3分；間歇性眼癢流淚為2分；偶有眼癢流淚為1分。癥狀改善百分率＝（治療前總分-治療4周后總分）∕治療前總分×100%。①顯效：癥狀改善百分率≥66%；②有效：癥狀改善百分率26%～65%；③無(wú)效：癥狀改善百分率≤25%。

1.10 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）、UniProt數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：∕∕www.uniprot.org∕）、GeneCards數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：∕∕www.genecards.org∕）、STRING數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：∕∕string-db.org∕）、DrugBank數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：∕∕www.drugbank.ca∕）對(duì)復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏潛在有效成分進(jìn)行篩選［10-11］，化合物篩選標(biāo)準(zhǔn)：DL≥0.18［12-14］或符合Lipinski類藥性五原則。通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，以Allergic rhinitis為關(guān)鍵詞，同時(shí)以來(lái)源為人類（homo sapiens）為條件，檢索和篩選AR相關(guān)的靶點(diǎn)。將每個(gè)化合物與其作用的AR靶點(diǎn)相聯(lián)系，采用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏的成分-AR相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。采用R語(yǔ)言中的Bioc-Manager包對(duì)復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏活性成分和AR共同靶點(diǎn)進(jìn)，基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，其中癥狀積分?jǐn)?shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較治療4周后，觀察組的總有效率明顯高于對(duì)照組，兩組臨床總有效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組變應(yīng)性鼻炎130例臨床療效比較∕例（%）

2.2 兩組治療前和治療4周后尿中LTE4水平治療前，觀察組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療4周后，兩組尿LTE4水平均顯著低于治療前（P＜0.001）。治療后，對(duì)照組、觀察組TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下降，組間相比，采用復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏的觀察組TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組變應(yīng)性鼻炎130例LTE4水平、血清炎性因子變化比較

表3 兩組變應(yīng)性鼻炎130例LTE4水平、血清炎性因子變化比較

注：LTE4水平為白三烯E4水平，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-4為白細(xì)胞介素-4，IL-6為白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-12為IL-12。

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2.3 活性化合物的篩選及其靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)篩選，共得到9個(gè)主要活性成分，包括山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、丁子香萜、2，3，8-三鄰甲基鞣花酸等，見(jiàn)表4。通過(guò)變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)篩選，得到AR相關(guān)靶點(diǎn)3 715個(gè)，復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏藥物靶點(diǎn)基因146個(gè)，并且得到復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的潛在靶點(diǎn)117個(gè)，其結(jié)果見(jiàn)圖1-Venn diagram。

表4 復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏的9個(gè)主要活性成分

2.4 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析將117個(gè)潛在靶點(diǎn)倒入String數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行蛋白互作分析，最后使用String繪制軟件構(gòu)建復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。Degree值越大表示該靶點(diǎn)為AR疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，與AR密切相關(guān)，選取Degree值前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建其關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3，4。前10個(gè)疾病靶點(diǎn)如下：AKT1、IL6、ALB、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8、PTGS2、MAPK1、MYC，表明前10個(gè)靶點(diǎn)在復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。

2.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建了復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR成分-靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5。其中綠色為活性成分，紫色為化合物作用的靶點(diǎn)，其中作用靶點(diǎn)117個(gè)，提示這些蛋白可作為復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的潛在靶點(diǎn)。

2.6 GO分析和KEGG通路富集分析為解釋復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的作用機(jī)制，采用R語(yǔ)言對(duì)復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏活性成分和AR共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析（圖6），共獲得117條GO生物學(xué)過(guò)程，其主要包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、四曲吡咯結(jié)合、氧化還原酶活性等，表明復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏可以通過(guò)多種生物學(xué)調(diào)控過(guò)程發(fā)揮治療AR的作用。

KEGG通路富集顯示復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集通路有108條，主要涉及流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、輔助性T細(xì)胞17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、甲型流感通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，根據(jù)P≤0.05選取排名靠前的30條通路，見(jiàn)表5。

表5 復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療變應(yīng)性鼻炎KEGG富集分析結(jié)果

3 討論

變應(yīng)性鼻炎發(fā)生機(jī)制和輔助性T淋巴細(xì)胞亞群Th1∕Th2平衡、炎性因子異常表達(dá)關(guān)系密切，炎性因子異常不僅在變應(yīng)性病變過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，而且其對(duì)疾病預(yù)后有一定影響［15］。在Th1∕Th2平衡中，Th1主要釋放Th1型細(xì)胞因子γ干擾素（IFN-γ）、IL-2抑制Th2釋放的炎性因子TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12，從而控制機(jī)體的免疫應(yīng)答。本研究治療后，兩組的TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12均有顯著下降，說(shuō)明在治療之后，病人體內(nèi)炎癥反應(yīng)多得到有效抑制，進(jìn)一步對(duì)組間數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，使用復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏的觀察組炎癥抑制效果顯著優(yōu)于常規(guī)治療的對(duì)照組，說(shuō)明其具有抑制炎癥反應(yīng)的效果。并且藥物可降低變應(yīng)性鼻炎病人尿LTE4水平，提示其一方面可能通過(guò)干預(yù)的生物合成或作用于白三烯（LTs）受體，抑制LTs的釋放，從而降低對(duì)中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等的趨化作用，使作用于鼻腔黏膜的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的數(shù)量降低，炎性細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)減少，從而達(dá)到減少鼻腔炎癥反應(yīng)的作用，從而達(dá)到緩解AR發(fā)作的目的。本研究中，將復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏直接涂于病人鼻腔黏膜，藥物成分可被鼻腔黏膜快速吸收，直接作用于鼻腔黏膜肥大細(xì)胞等致敏細(xì)胞，改善細(xì)胞功能，在達(dá)到快速緩解癥狀的同時(shí)，減少藥物用量，避免不良反應(yīng)發(fā)生。若將其涂抹于身體其他部位，其效果明顯不如涂抹于鼻腔黏膜處。本研究治療期間，觀察組所有病人未見(jiàn)鼻腔黏膜損傷或黏膜功能減退者，說(shuō)明將復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏直接涂于病人鼻腔黏膜具有較高的安全性。而長(zhǎng)期大量使用丙酸氟替卡松等激素類藥物則易導(dǎo)致聲嘶、鼻衄等多種不良反應(yīng)。

通過(guò)篩選，共得到9個(gè)主要活性成分，其中槲皮素可抑制一氧化氮（NO）、前列腺素D2（PGD2）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）的水平，并通過(guò)抑制核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用［16］；山柰酚能夠有效降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶-4（NOX4）、吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的一個(gè)亞單位p67phox蛋白的表達(dá)量，從而發(fā)揮抗氧化作用［17］。胡蘿卜甙功能廣泛，具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用［18］。2，3，6-O-三沒(méi)食子酰甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-O-雙沒(méi)食子酰甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、2，3，8-三鄰甲基鞣花酸是地榆中糖苷類成分，有研究表明，有研究發(fā)現(xiàn)地榆中的抗炎活性物質(zhì)是糖苷類化合物，能顯著降低IL-1β水平，升高IL-10水平，且明顯下調(diào)NFκB蛋白活性，具有明顯的抗炎效果［19-20］。

變應(yīng)性鼻炎是變應(yīng)原進(jìn)入人體后，經(jīng)巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞處理后，產(chǎn)生IgE抗體，附著于肥大細(xì)胞等的細(xì)胞膜上，因而使鼻黏膜致敏。當(dāng)變應(yīng)原再次進(jìn)入人體時(shí)，與IgE結(jié)合，使肥大細(xì)胞膜變構(gòu)，釋放出大量生物活性介質(zhì)如組胺、白三烯、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、血小板活化因子、TNF-α、IL-4，IL-6及IL-12等［21］。本研究治療后，觀察組的總有效率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療變應(yīng)性鼻炎可有效改善病人臨床癥狀。丙酸氟替卡松可經(jīng)抑制白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放細(xì)胞因子，發(fā)揮抗過(guò)敏、抗炎作用，達(dá)到緩解臨床癥狀的目的。與丙酸氟替卡松治療變應(yīng)性鼻炎相比較，復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR機(jī)制更加復(fù)雜。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR可能是通過(guò)PTGS2、IL-6、MAPK1、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮作用，其中PTGS2與炎癥和有絲分裂發(fā)生相關(guān)的前列腺素生物合成有關(guān)，MAPK蛋白激酶調(diào)控著炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理∕病理過(guò)程，其中P38MAPK∕NF-κB通路是經(jīng)典的炎癥免疫通路，是一種重要的炎癥調(diào)控因子［22-23］。復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR可能參與調(diào)控AGE-RAGE、TNF、IL-17炎性因子通路等多條通路信號(hào)，通過(guò)控制其中炎性因子的釋放、激素的水平、Th1∕Th2平衡來(lái)對(duì)AR起治療作用。本研究的臨床研究也證實(shí)，復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏可降低AR病人TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12炎性因子水平，從而改善其癥狀。本研究因治療時(shí)間相對(duì)較短，所得結(jié)果可能存在一定偏差。

綜上所述，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合臨床研究，初步闡明了復(fù)方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的作用機(jī)制，可能是通過(guò)作用于PTGS2、IL-6、MAPK1等靶點(diǎn)參與調(diào)控AGE-RAGE、TNF、IL-17等信號(hào)通路，發(fā)揮控制炎癥的作用，從而控制AR的發(fā)生，此為后續(xù)復(fù)方木芙蓉涂鼻軟的藥理機(jī)制分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了理論支撐。

（本文圖1～6見(jiàn)插圖1-7）