微小RNA-646對膠質母細胞瘤細胞系U251增殖和轉移的影響

張傳政，常欣辛，張曉東，費帆

膠質母細胞瘤是常見的顱內腫瘤，較高的侵襲力、惡性程度和復發(fā)率使其病人預后不佳［1］。微小RNA（miRNAs，miR）參與包括膠質母細胞瘤在內的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2-4］。miR-646是miR-15∕107基因群成員，最初在人大腦白質和灰質中發(fā)現(xiàn)，近年來被證實在肺腺癌、結直腸癌和胃癌等多種腫瘤中異常低表達，與腫瘤大小、淋巴結轉移和分期等有關，在腫瘤進展中miR-646充當抑癌基因［5-7］。有學者通過癌癥基因組圖譜篩選563例膠質母細胞瘤病人的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-646的低表達與膠質母細胞瘤病人的不良預后相關［8］，然而miR-646在膠質母細胞瘤中的表達及作用并不明了。因此，本研究假設miR-646同樣充當抑癌因子參與膠質母細胞瘤的進展。本研究以人膠質母細胞瘤細胞系U251為研究對象，旨在探討miR-646對U251細胞惡性行為的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料2018年5月至2019年5月，正常星形膠質細胞HNAs、人膠質母細胞瘤細胞系SHG44、A172和U251（中科院上海細胞庫），胎牛血清（杭州四季青），青鏈霉素混合液（北京索萊寶），1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Trizol試劑、脂質體2000和MTT試劑（美國Invitrogen），二甲基亞砜（上海博光生物），miR-646模擬物、miR-646抑制劑及其相應對照（廣州銳博生物）。上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經鈣黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和β-肌動蛋白（βactin）抗體（美國CST），叉頭框K1（forkhead box K1，F(xiàn)OXK1）抗體（上海鈺博生物），辣根過氧化酶標記的二抗（北京中杉金橋）。Bradford法蛋白檢測試劑盒（聯(lián)科生物），雙熒光Luciferase檢測試劑盒（美國Promega），反轉錄試劑盒（日本Takara）。實時熒光定量PCR儀和二氧化碳培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子），倒置顯微鏡（英國BioPulverizer），PCR擴增儀和凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad）。

2014年1月至2016年1月，從成都市第六人民醫(yī)院采集了14對神經膠質瘤樣本和相鄰的非腫瘤樣本，然后在液氮中速凍并保存在-80℃用于RNA的提取和檢測。根據(jù)WHO對中樞神經系統(tǒng)腫瘤的分類，對所有參與本研究的病人進行了組織學診斷。所有病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將U251細胞接種至1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素）上，常規(guī)培養(yǎng)。待生長至80%融合時，以1∶3比例進行傳代，第3代細胞用于實驗。

1.2.2 分組與轉染將U251細胞接種在6孔板（100 000個∕孔）中，培養(yǎng)至80%匯合度時進行轉染，分為六組：①模擬物對照組：模擬物陰性對照轉染細胞；②miR-646模擬物組：miR-646模擬物轉染細胞；③抑制劑對照組：轉染miR-646抑制劑對照；④miR-646抑制劑組：轉染miR-646抑制劑；⑤miR-646模擬物+pcDNA-FOXK1組：共轉染miR-646模擬物和FOXK1過表達質粒pcDNA-FOXK1；⑥miR-646模擬物+pcDNA組：共轉染miR-646模擬物和過表達空載質粒pcDNA。轉染4 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞進行指標檢測。每組3個重復。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測miR-646表達Trizol法提取組織∕細胞總RNA，將RNA逆轉錄互補DNA（cDNA）進行擴增。PCR反應體系：1 μL cDNA、10 μL SYB Green、正反向引物各0.5 μL，加去離子水補至20 μL。反應過程為95℃預變性1 min后，進入40個循環(huán)過程：95℃、10s，60℃、40s，72℃、30s。2-ΔΔCt法計算miR-646的相對表達量，U6為內參。引物序列如下：miR-646正向5'-ACACTCCAGCTGGGAAGCAGCTGCCTC-3'，反向5'-CTCAACTGTGCTGCATTAGTTAGCTCAGA-3'；U6正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖將對數(shù)生長期U251細胞根據(jù)“1.2.2”中的分組轉染48 h后，胰酶消化收集各組細胞，并接種至96孔板上（5 000個細胞∕孔），培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，加入MTT溶液（5 g∕L，每孔20 μL），孵育4 h后，加入二甲基亞砜（每孔150 μL）溶解甲瓚晶體，檢測各孔吸光度值。

1.2.5 克隆形成實驗將對數(shù)生長期U251細胞根據(jù)“1.2.2”中的分組轉染后，胰酶消化收集各組細胞，以每孔800個細胞接種至6孔板中，并保持14 d以上。當細胞克隆可見時，用0.1%結晶紫溶液染色，于顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)（大于50個細胞）。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移將各組U251細胞用無血清培養(yǎng)基重懸并調整為1 000 000個細胞∕毫升。侵襲實驗時前，使用50 mg∕L的Matrigel基質膠鋪于Transwell小室底部膜上，并在4℃下風干。遷移實驗則直接使用無基質膠包被的小室。將小室放入24孔板內，取200 μL細胞懸液加入上室，600 μL培養(yǎng)基（含胎牛血清）加入到下室。培養(yǎng)24 h后，取出小室，將上室膜表面內細胞擦去，膜下表面細胞用乙醇固定30 min后，用0.5%結晶紫染色15 min。于顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.2.7 劃痕實驗檢測細胞遷移胰酶消化收集各組細胞，以每孔2 000個細胞接種于6孔板中，并將細胞保持在37℃，5%二氧化碳中直至細胞長滿培養(yǎng)板。然后，將200 μL微量移液器在培養(yǎng)板中垂直劃直線，創(chuàng)建傷口區(qū)域。分別于劃痕后即刻和48 h計算劃痕愈合率［9］，評估細胞的遷移能力。

1.2.8 蛋白質印跡法檢測細胞中FOXK1和上皮間質轉化相關蛋白表達向U251細胞中加入細胞裂解液裂解提取總蛋白，測定總蛋白濃度后，SDSPAGE分離蛋白樣品（50 μg），并轉膜。將膜用5%脫脂奶粉封閉2 h后，與一抗工作液（E-cadherin 1∶200、N-cadherin 1∶500、Vimentin 1∶1 000和FOXK1 1∶1 000）在4℃下孵育24 h，再與二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h?；瘜W發(fā)光劑顯影后，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析蛋白條帶的灰度值，β-actin為內參。

1.2.9 雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-646和FOXK1的靶向關系將FOXK1的3'UTR片段克隆并重組至pGL3-basic螢光素酶報告基因載體上，將其作為FOXK1野生型載體；另外，將miR-646與突變后的FOXK1 3’UTR克隆重組至pGL3-basic螢光素酶報告基因載體上構建FOXK1突變型載體。將構建的FOXK1野生型和FOXK1突變型載體參照脂質體2000說明書分別與miR-646模擬物、模擬物對照或miR-646抑制劑、抑制劑對照共轉染至U251細胞中，轉染48 h后，收集細胞檢測螢光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法每組3個復孔，實驗重復3次。結果以±s表示，SPSS 22.0軟件用于統(tǒng)計學分析，采用獨立樣本t檢驗用于兩組間比較，單因素方差分析和SNK-q檢驗用于三組及以上的組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-646在膠質瘤組織中的表達膠質瘤組織中miR-646表達水平0.36±0.03明顯低于正常腦組織1.00±0.06（t=16.53，P＜0.001）。

2.2 miR-646在膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中的表達與HNAs細胞（1.00±0.08）相比，膠質瘤細 胞SHG44、A172和U251（0.54±0.04、0.63±0.06、0.38±0.04）中miR-646表達水平顯著降低（P＜0.05），其中U251細胞差異最顯著。

2.3 轉染后各組U251細胞中miR-646表達與模擬物對照組（1.00±0.11）相比，miR-646模擬物組（5.28±0.53）miR-646水平升高（P＜0.05）；與抑制劑對照組（1.00±0.10）相比，miR-646抑制劑組（0.24±0.03）miR-646水平降低（P＜0.05）。

2.4 miR-646對U251細胞增殖的影響與各自非特異性對照相比，miR-646模擬物組細胞在24 h、48 h和72 h的增殖活力明顯降低，細胞克隆形成數(shù)明顯減少，而miR-646抑制劑組細胞的增殖活力明顯增強，細胞克隆形成數(shù)顯著增加（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 miR-646對U251細胞增殖的影響

表1 miR-646對U251細胞增殖的影響

注：①與模擬物對照組相比，P＜0.05。②與抑制劑對照組相比，P＜0.05。

組別模擬物對照miR-646模擬物抑制劑對照miR-646抑制劑F值P值重復次數(shù)3 3 3 3吸光度（570 nm）24 h 0.72±0.06 0.45±0.03①0.81±0.05 1.06±0.11②39.83＜0.001 48 h 1.22±0.13 0.86±0.05①1.16±0.09 1.47±0.20②11.17 0.003 72 h 1.64±0.23 1.05±0.09①1.57±0.15 2.12±0.31②12.81 0.002細胞克隆形成數(shù)∕個102.44±9.14 51.24±5.36①98.65±8.36 165.22±11.23②85.15＜0.001

2.5 miR-646對U251細胞侵襲的影響與各自非特異性對照（75.36±6.62）相比，轉染miR-646模擬物可使U251細胞侵襲能力明顯減弱（75.36±6.62比46.55±3.16），而轉染miR-646抑制劑后U251細胞侵襲 能 力明顯增 強（68.82±7.05比101.25±9.95，P＜0.05）。見圖2。

2.6 miR-646對U251細胞遷移的影響與各自非特異性對照相比，轉染miR-646模擬物可使U251細胞遷移能力明顯減弱，劃痕愈合率顯著降低，而轉染miR-646抑制劑后U251細胞遷移能力明顯增強，劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）。見表2，圖3。

表2 各組中遷移細胞數(shù)的比較

表2 各組中遷移細胞數(shù)的比較

注：①與模擬物對照組相比，P＜0.05。②與抑制劑對照組相比，P＜0.05。

組別模擬物對照miR-646模擬物抑制劑對照miR-646抑制劑F值P值重復次數(shù)3 3 3 3遷移細胞數(shù)∕個151.28±13.50 98.75±8.82①135.46±11.65 182.32±15.24②23.09＜0.001劃痕愈合率∕%46.21±4.22 20.13±2.65①40.58±4.69 69.52±5.14②67.58＜0.001

2.7 miR-646對U251細胞上皮間質轉化的影響與各自非特異性對照相比，miR-646模擬物可明顯促進U251細胞中上皮標志物E-cadherin蛋白表達，且顯著抑制間質標志物N-cadherin和Vimentin蛋白的表達（P＜0.05）；而miR-646抑制劑作用結果恰好與miR-646模擬物結果相反，可明顯抑制E-cadherin并 促 進N-cadherin和Vimentin蛋 白 的 表 達（P＜0.05）。見表3，圖4。

表3 各組細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達的比較s

表3 各組細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達的比較s

注：E-cadherin為上皮鈣黏素，N-cadherin為神經鈣黏素，Vimentin為波形蛋白。①與模擬物對照組相比，P＜0.05。②與抑制劑對照組相比，P＜0.05。

組別模擬物對照miR-646模擬物抑制劑對照miR-646抑制劑F值P值重復次數(shù)3 3 3 3 E-cadherin 0.38±0.03 0.66±0.04①0.36±0.03 0.14±0.02②143.47＜0.001 N-cadherin 0.47±0.03 0.21±0.02①0.52±0.04 1.19±0.12②121.04＜0.001 Vimentin 0.55±0.04 0.18±0.03①0.50±0.03 0.72±0.06②87.24＜0.001

圖4 蛋白質印跡法檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達

2.8 FOXK1是miR-646的 靶 基 因Targetscan數(shù)據(jù)庫預測到FOXK1的3'UTR區(qū)域存在miR-646的結合位點。雙螢光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，與各自非特異性對照相比，miR-646模擬物可使轉染FOXK1 3'UTR野生型質粒的U251細胞螢光素酶活性降低（P＜0.05），而miR-646抑制劑處理則得到相反的結果，可升高細胞的螢光素酶活性（P＜0.05）；但是，miR-646模擬物或抑制劑與FOXK1 3'UTR突變型質粒共轉染的U251細胞螢光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。與各自非特異性對照相比，miR-646模擬物可明顯抑制U251細胞中FOXK1蛋白表達（P＜0.05）；而miR-646抑制劑作用結果恰好與miR-646模擬物結果相反，可明顯促進FOXK1蛋白的表達（P＜0.05）。見表4，圖5。

表4 各組細胞螢光素酶活性和FOXK1蛋白水平比較s

表4 各組細胞螢光素酶活性和FOXK1蛋白水平比較s

注：FOXK1為叉頭框K1。①與模擬物對照組相比，P＜0.05。②與抑制劑對照組相比，P＜0.05。

組別模擬物對照miR-646模擬物抑制劑對照miR-646抑制劑F值P值重復次數(shù)3 3 3 3螢光素酶活性FOXK1-野生型1.00±0.12 0.29±0.02①1.00±0.11 4.21±0.42②181.91＜0.001 FOXK1-突變型1.00±0.13 0.93±0.08 1.00±0.10 0.96±0.09 0.34 0.800 FOXK1蛋白0.51±0.04 0.28±0.03①0.55±0.03 0.92±0.06②120.29＜0.001

圖5 miR-646靶向調節(jié)FOXK1表達：A為Targetscan數(shù)據(jù)庫預測的FOXK1與miR-646的結合位點；B為FOXK1蛋白表達

2.9 FOXK1過表達逆轉了miR-646過表達對U251細胞增殖和轉移的作用與miR-646模擬物+pcDNA相 比，miR-646模 擬 物+pcDNA-FOXK1組可明顯提高U251細胞24 h、48 h和72 h的增殖活力、細胞克隆形成數(shù)，明顯增強細胞的侵襲、遷移能力，明顯增加劃痕愈合率（P＜0.05）。見表5，圖6。

表5 FOXK1過表達逆轉了miR-646過表達對U251細胞增殖和轉移的作用∕xˉ±s

3 討論

目前，膠質母細胞瘤的治療仍以手術切除和放化療為主，但由于腫瘤內和腫瘤間異質性的存在，使其治療易產生藥物抗性和復發(fā)；鑒于中樞神經系統(tǒng)的復雜性和腫瘤細胞的高侵襲性，有效的治療方案是一直是膠質母細胞瘤臨床治療的重要需求［10］。miRNAs是內源性非編碼RNA，影響多數(shù)生物學過程，如細胞增殖、轉移等，與膠質母細胞瘤發(fā)生發(fā)展密切相關［11-12］，而尋找和確認能夠改善膠質母細胞瘤惡性進展的miRNA對其治療具有重要意義。

miR-646是miRNAs中重要一員，被證實與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。胃癌組織中miR-646的表達與鄰近的正常組織相比明顯下調，且低表達的miR-646與胃癌的惡性程度密切相關；上調其表達不僅可抑制腫瘤細胞的生長和遷移，還可抑制TGF-β1誘導的上皮間質轉化［7］。在骨肉瘤發(fā)病機制的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-646可通過靶向調控表皮生長因子受體抑制U2OS細胞增殖和遷移［13］。另外，miR-646高表達可還調控EGFR∕Akt通路抑制肺癌A549細胞增殖擴散［14］。之后，miR-646還在肝癌［15］和子宮內膜癌［16］等腫瘤中有報道。目前，關于miR-646是否參與膠質母細胞瘤的發(fā)病機制并不清楚。本研究體外細胞實驗結果顯示，上調miR-646表達減弱膠質母細胞瘤U251細胞增殖、克隆形成、侵襲、遷移能力并延緩上皮間質轉化進程；而下調miR-646表達則表現(xiàn)出相反作用。提示，miR-646可抑制U251細胞的惡性行為，在膠質母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的抑癌作用。

Fox基因家族是細胞內重要的轉錄因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［17-18］。FOXK1是FOX家族成員，在多種腫瘤中異常高表達，參與細胞增殖、上皮間質轉化、浸潤和轉移，如胃癌、食管癌和肝癌［19-21］。已有研究證實，F(xiàn)OXK1在膠質母細胞瘤組織和細胞中異常高表達，且可通過增強S期細胞群促進細胞增殖，激活Snail轉錄加快細胞上皮間充質轉化和轉移［22］。另外，有研究指出在胃癌中miR-646可通過靶向調控FOXK1抑制癌細胞增殖和轉移［23］。由此可見，F(xiàn)OXK1在膠質瘤等腫瘤中充當癌基因，促進癌癥進展。在本研究中，F(xiàn)OXK1被預測是miR-646的潛在靶基因，雙螢光素酶實驗證實miR-646與FOXK1 3’UTR存在靶向調控關系；蛋白質印跡法結果顯示，miR-646過表達可降低FOXK1蛋白水平，而敲低miR-646則有相反作用，進一步證實了FOXK1是miR-646靶基因。為了進一步探索靶向FOXK1是否是miR-646調控膠質瘤發(fā)生發(fā)展的重要途徑，本研究在膠質瘤U251細胞中同時轉染miR-646模擬物和FOXK1過表達質粒pcDNAFOXK1，結果顯示，F(xiàn)OXK1過表達可明顯減弱miR-646過表達對U251細胞惡性進展的影響。這些結果提示，miR-646可能通過靶向調控FOXK1表達介導細胞增殖和轉移。

綜上所述，miR-646過表達可能通過靶向負調控FOXK1表達抑制U251細胞增殖和轉移。本研究僅從單種膠質母細胞瘤細胞系和細胞水平上初步闡述了miR-646的作用，還需在多種腫瘤細胞系和動物水平上進一步驗證；同時miR-646抑制膠質母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制十分復雜，還有待進一步深入研究。

（本文圖1～3，6見插圖1-6）

圖1 各組細胞的克隆形成（結晶紫染色×10） 圖2 各組U251細胞的侵襲（結晶紫染色×200） 圖3 各組U251細胞的遷移：3A為Transwell小室實驗（結晶紫染色×200）；3B為劃痕實驗（×100）圖6 FOXK1過表達逆轉了miR-646過表達對U251細胞增殖和轉移的作用：6A為細胞克隆形成實驗（結晶紫染色×10）；6B為Transwell小室實驗（結晶紫染色×200）；6C為劃痕實驗（×100）