婦科九味洗劑高效液相色譜法特征指紋圖譜及成分定量研究

徐斌，梁朝鋒，韓曉珂

婦科九味洗劑（批準(zhǔn)文號(hào)為皖藥制字Z20050018）是由蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院婦科專家根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，聯(lián)合本制劑中心制成的以清熱解毒、殺蟲滅菌為主要功效的純中藥制劑，其主要提取工藝為加水提取兩次，合并濃縮而成，用于治療細(xì)菌性、霉菌性、滴蟲性陰道炎及宮頸炎等癥，療效確切，作用顯著，在我院婦科應(yīng)用廣泛，作為我院產(chǎn)業(yè)化明星產(chǎn)品之一，帶來了顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。藥理研究表明，方中白鮮皮、蒲公英、紫花地丁、野菊花均具有清熱解毒等功效［1-4］，而苦參、蛇床子、百部、地膚子、土荊皮均具有抗菌殺蟲等功效［5-9］。

目前本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅采用薄層色譜法對(duì)苦參和蛇床子進(jìn)行定性鑒別，已無法適用現(xiàn)代中藥對(duì)質(zhì)量控制的需求。而中藥指紋圖譜著眼于中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠全面地反映制劑包含的化學(xué)信息，有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量［10-12］。本研究于2020年5—8月，首次建立了婦科九味洗劑的HPLC特征圖譜，并對(duì)其中咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷的含量進(jìn)行定量研究，通過相似度評(píng)價(jià)，為全面評(píng)價(jià)本制劑的質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

儀器：Waters e2695高效液相色譜儀，包括2695四元泵，2489紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；XP205型電子天平，Mettler Toledo公司。

材料：13批婦科九味洗劑樣品由本院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)為200610（S1）、200606（S2）、200531（S3）、200112（S4）、191117（S5）、191022（S6）、191008（S7）、191002（S8）、190907（S9）、190905（S10）、190804（S11）、190803（S12）、190612（S13）。相關(guān)飲片信息見表1。木犀草苷（批號(hào)111720-201609），咖啡酸（批號(hào)110885-200102），蒙花苷（批號(hào)111528-201308），以上對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均≥98%；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱安捷倫Zorbax-SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇為流動(dòng)相A，0.4%甲酸為流動(dòng)相B，波長(zhǎng)334 nm，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30℃［13］。按下表2進(jìn)行梯度洗脫。

表2 梯度洗脫程序表

2.2 供試品溶液的制備精密量取樣品（S1-S13）2 mL，置50 mL量瓶中，加入稀乙醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm），取續(xù)濾液，即可。

2.3 指紋圖譜研究結(jié)果

2.3.1 精密度試驗(yàn)取樣品（S1）供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以7號(hào)色譜峰為參照，計(jì)算16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均≤0.11%，相對(duì)峰面積的RSD均≤2.98%，表示精密度良好，符合2020年中國(guó)藥典四部附錄（通則9101）關(guān)于液相色譜測(cè)定有關(guān)規(guī)定。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品（S1）供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，分別在0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)間下進(jìn)樣，以7號(hào)色譜峰為參照，計(jì)算其余各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均≤0.09%，相對(duì)峰面積的RSD均≤2.99%，說明樣品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。符合2020年中國(guó)藥典四部附錄（通則9101）關(guān)于液相色譜測(cè)定有關(guān)規(guī)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)取樣品（S1）6份供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，以7號(hào)色譜峰為參照，計(jì)算其余各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均≤2.88%，相對(duì)峰面積的RSD均≤3.10%，重復(fù)性良好。符合2020年中國(guó)藥典四部附錄（通則9101）關(guān)于液相色譜測(cè)定有關(guān)規(guī)定。

2.3.4 特征指紋圖譜結(jié)果與分析取上述13批婦科九味洗劑供試液，按照“2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。打開“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版），將得到的各批樣品色譜圖數(shù)據(jù)輸入后進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，設(shè)置S1為參照?qǐng)D譜，運(yùn)用中位數(shù)法，時(shí)間寬度為0.1，經(jīng)過多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后生成對(duì)照指紋圖譜（R）和13批制劑樣品的疊加指紋圖譜，得到16個(gè)共有峰。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）進(jìn)行分析，計(jì)算13批制劑樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。

13批制劑樣品號(hào)：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13的相似度分別為0.967、0.975、0.962、0.945、0.912、0.991、0.981、0.994、0.989、0.992、0.998、0.977、0.945；均值為0.971±0.025。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，13批制劑與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均＞0.91，相似度良好［14-16］。

通過與對(duì)照品色譜圖比對(duì)，指認(rèn)出3個(gè)成分，分別為5號(hào)峰咖啡酸，9號(hào)峰木犀草苷，13號(hào)峰蒙花苷。13批樣品特征指紋圖譜見圖1。

圖1 婦科九味洗劑13批樣品HPLC特征指紋圖譜

2.4 3種成分的含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察精密稱取咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷對(duì)照品各14.55、11.80、12.55 mg，加甲醇制成濃度分別為58.2、47.2、62.75 mg∕L的對(duì)照品母液，分別從各個(gè)母液中精密量取5、10、16 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得各濃度分別為5.82、9.44、20.08 mg∕L的混合對(duì)照品溶液。在“2.1”色譜條件下分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，以進(jìn)樣量和峰面積作為橫坐標(biāo)（X）和縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，見表3。

表3 婦科九味洗劑各成分定量的線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 精密度試驗(yàn)取樣品（S1）供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)樣量5 μL，連續(xù)測(cè)定6次，得到咖啡酸峰面積（RSD=0.90%）、木犀草苷峰面積（RSD=2.06%）、蒙花苷峰面積（RSD=0.98%），表示精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品（S1）供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)樣量5 μL，分別在0、2、4、6、12、24 h時(shí)間下進(jìn)樣分析，測(cè)得咖啡酸峰面積（RSD=1.41%）、木犀草苷峰面積（RSD=0.80%）、蒙花苷峰面積（RSD=0.70%），符合2020年中國(guó)藥典四部附錄（通則9101）關(guān)于液相色譜測(cè)定有關(guān)規(guī)定。提示在24 h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取上述樣品供試品6份，注入液相色譜儀，進(jìn)樣量5 μL，測(cè)得咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷的平均含量和RSD分別為0.164 6 g∕L（RSD=1.79%）、0.132 3 g∕L（RSD=2.07%）、0.340 5 g∕L（RSD=1.59%），表明重復(fù)性良好。符合2020年中國(guó)藥典四部附錄（通則9101）關(guān)于液相色譜測(cè)定有關(guān)規(guī)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)精密量取S1供試品溶液1 mL，共6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入咖啡酸（58.2 mg∕L）3.3 mL、木犀草苷（47.2 mg∕L）2.8 mL、蒙花苷（62.75 mg∕L）5.5 mL，加入稀乙醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm），取續(xù)濾液，即可。將得到的供試液注入液相色譜儀，進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果各個(gè)成分平均加樣回收率分別為100.8%、98.1%、100.4%，RSD分別為1.16%、1.81%、1.06%。符合2020年中國(guó)藥典四部附錄（通則9101）關(guān)于液相色譜測(cè)定有關(guān)規(guī)定。

2.4.6 含量測(cè)定取13批婦科九味洗劑（S1-S13）各2 mL，按照“2.2”方法進(jìn)行處理后，依據(jù)“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，混合對(duì)照品及樣品色譜圖見圖2，表4。

圖2 婦科九味洗劑樣品及混合對(duì)照品HPLC色譜圖：A為樣品；B為混合對(duì)照品

表4 婦科九味洗劑13批樣品中3種成分含量測(cè)定結(jié)果∕（g∕L）

3 討論

3.1 流動(dòng)相及波長(zhǎng)的確定研究考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.4%甲酸、乙腈-0.2%甲酸系統(tǒng)對(duì)特征圖譜的分離情況，通過分析各個(gè)系統(tǒng)對(duì)整個(gè)色譜峰的分離效果及特征峰信息量，最終確定甲醇-0.4%甲酸作為流動(dòng)相。通過全波長(zhǎng)掃描，重點(diǎn)對(duì)波長(zhǎng)230、250、270、300、334、350 nm下的特征指紋圖譜進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在334 nm下，特征圖譜的信息量較大，特征峰的響應(yīng)值較高，基線平穩(wěn)度較好。

3.2 共有峰的確認(rèn)及來源婦科九味洗劑HPLC特征指紋圖譜共標(biāo)定出共有峰16個(gè)，通過對(duì)照品比對(duì)，識(shí)別出咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷成分，查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，蒙花苷為野菊花特有成分，咖啡酸和木犀草苷在野菊花和蒲公英中均存在［17-19］。

3.3 批間差異性分析13批樣品生產(chǎn)中部分飲片來自于不同批次，故3個(gè)成分的含量存在一定的差異，但13批樣品相似度均＞0.91，說明批間差異性較小，各個(gè)批次相似度較好，表明該生產(chǎn)工藝具有較好的穩(wěn)定性和較高的成分保留率。

本研究首次建立了婦科九味洗劑HPLC特征指紋圖譜及咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷三種成分含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便快捷，實(shí)用性強(qiáng)，為有效地控制本制劑的質(zhì)量提供了科學(xué)的方法。后續(xù)研究將建立更多的成分測(cè)定，以期能更全方位控制制劑的質(zhì)量。