黃芪通過微小RNA-133a抑制Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子信號通路抑制膀胱癌的遷移和侵襲

祝仰廷，李剛，孫偉，劉丙峰，賈浩，江山，厲昌杰

膀胱癌是常見的泌尿系統腫瘤，其復發(fā)率和死亡率高，且易發(fā)生轉移［1］。研究表明中醫(yī)藥在治療膀胱癌中具有增效減毒作用［2］。因此，尋找可以抑制膀胱癌細胞轉移的中藥及其作用的分子機制對膀胱癌的治療具有重要意義。黃芪是豆科植物膜莢黃芪的干燥根，主要成分為黃芪多糖、皂苷、黃酮等，具有抗腫瘤作用［3］。研究報道黃芪可抑制喉癌細胞增殖和侵襲，并促進細胞凋亡［4］。黃芪多糖增強了阿帕替尼對胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用［5］。然而黃芪對膀胱癌細胞遷移和侵襲的影響及其機制尚不清楚。研究表明miRNA參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展也密切相關［6］。研究報道m(xù)iR-133a在膀胱癌病人中低表達，其表達水平可作為膀胱癌非侵入性診斷標志物，及膀胱癌治療的新靶點［7］。而黃芪多糖通過上調miR-133a可減少人骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［8］。此外有研究報道m(xù)iR-153可通過抑制Janus激酶∕信號轉導和轉錄激活因子（Janus kinase∕signal transducer and activator of transcription，JAK∕STAT）信號通路抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力［9］。因此，本研究于2019年8月至2020年2月進行，旨在研究黃芪對膀胱癌細胞遷移和侵襲的影響以及其機制是否與miR-133a和JAK∕STAT信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 材料T24細胞購自美國模式培養(yǎng)物研究所（ATCC）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；黃芪購自北京凱瑞基生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒購自碧云天生物技術研究所；抗體購自上海信裕生物技術有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國Bio-Rad公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；JAK∕STAT信號通路特異性阻滯劑AG490購自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)T24細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，2 d換液一次，待細胞融合至80%左右時，進行消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞處理與分組取對數生長期T24細胞，用濃度分別為40 mg∕L、80 mg∕L、160 mg∕L的黃芪處理T24細胞，作為不同濃度黃芪組；正常培養(yǎng)的細胞作為對照（NC）組，后續(xù)實驗中采用160 mg∕L的黃芪處理記為黃芪組。將miR-133a模擬物（mimic）陰性對照（miR-NC）、miR-133a mimic（miR-133a）、miR-133a抑制劑（inhibitor）陰性對照（anti-miR-NC）、miR-133a inhibitor（anti-miR-133a）分別轉染至T24細胞中，記為miR-NC組、miR-133a組、anti-miR-NC組、anti-miR-133a組；將anti-miR-NC、anti-miR-133a分別轉染至T24細胞中再用濃度為160 mg∕L的黃芪處理，記為黃芪+anti-miR-NC組、黃芪+anti-miR-133a組；將anti-miR-133a轉染至T24細胞后再分別用濃度為160 mg∕L的黃芪和10 μmol AG490處理，記為黃芪+anti-miR-133a+AG490組。轉染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.4 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-2，MMP-9）、磷酸化Janus激酶1（p-JAK1）、磷酸化信號轉導和轉錄激活因子6（p-STAT6）蛋白表達各組細胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育90 min，TBST洗滌，用ECL發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統成像，用Quantity One凝膠分析軟件測定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值∕β-actin條帶灰度值。

1.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲細胞遷移實驗：分別將500 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)液和200 μL細胞懸液加入Transwell小室的下室和上室，然后于恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h。取出小室，吸去培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，計算結晶紫染色細胞數即為遷移細胞數。細胞侵襲實驗：將60 μL Matrigel加入300 μL無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中混勻，然后取100 μL平鋪于Transwell小室的上室，凝固后按遷移實驗操作進行。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-133a表達水平各組細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，進行PCR擴增，循環(huán)條件為95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-133a以U6為內參，miR-133a：正向引物序列5'-TAACAGTCTACAGCCA-3'，反向引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6：正向引物序列5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.7 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，總體有差異進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響與對照組相比，不同濃度黃芪組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平降低，細胞遷移和侵襲數量降低（P＜0.05），見圖1，表1。

表1 不同濃度黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響s

表1 不同濃度黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響s

注：MMP-2為基質金屬蛋白酶2，MMP-9為基質金屬蛋白酶9。①與對照組比較，P＜0.05。

組別對照組40 mg∕L黃芪組80 mg∕L黃芪組160 mg∕L黃芪組F值P值重復次數3 3 3 3 MMP-2蛋白相對表達量0.88±0.07 0.72±0.07①0.55±0.04①0.36±0.03①48.74＜0.001 MMP-9蛋白相對表達量0.95±0.08 0.79±0.06①0.60±0.05①0.40±0.04①48.14＜0.001細胞遷移數175.43±16.02 141.23±13.27①107.46±10.14①81.42±8.05①33.35＜0.001細胞侵襲數142.55±14.03 122.24±10.25①89.38±7.45①71.23±8.01①29.27＜0.001

圖1 蛋白質印跡法檢測黃芪處理的T24細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達

2.2 黃芪對T24細胞中miR-133a表達水平和JAK/STAT信號通路的影響（160 mg/L黃芪）與對照組相比，黃芪組miR-133a相對表達水平升高，p-JAK1、p-STAT6蛋白相對表達水平降低（P＜0.05），見圖2，表2。

表2 黃芪對T24細胞中miR-133a表達水平和JAK∕STAT信號通路的影響s

表2 黃芪對T24細胞中miR-133a表達水平和JAK∕STAT信號通路的影響s

注：miR-133a為微小RNA-133a，p-JAK1為磷酸化Janus激酶1，p-STAT6為磷酸化信號轉導和轉錄激活因子6。

組別對照組黃芪組t值P值重復次數3 3 miR-133a相對表達量1.00±0.11 2.36±0.21 5.74＜0.001 p-JAK1蛋白相對表達量0.55±0.04 0.12±0.01 10.43＜0.001 p-STAT6蛋白相對表達量0.38±0.03 0.08±0.01 9.49＜0.001

圖2 蛋白質印跡法檢測黃芪處理的T24細胞p-JAK1、p-STAT6蛋白的表達

2.3 miR-133a對T24細胞遷移和侵襲的影響與miR-NC組相比，miR-133a組miR-133a相對表達水平升高，MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平降低，細胞遷移和侵襲數量降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-133a組miR-133a相對表達水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平升高，細胞遷移和侵襲數量升高（P＜0.05），見圖3，表3。

表3 miR-133a對T24細胞遷移和侵襲的影響

表3 miR-133a對T24細胞遷移和侵襲的影響

注：MMP-2為基質金屬蛋白酶2，MMP-9為基質金屬蛋白酶9。①與miR-NC比較，P＜0.05。②與anti-miR-NC比較，P＜0.05。

組別miR-NC miR-133a anti-miR-NC anti-miR-133a F值P值重復次數3 3 3 3 miR-133a相對表達量1.00±0.11 2.73±0.25①1.02±0.13 0.46±0.04②125.41＜0.001 MMP-2蛋白相對表達量0.86±0.07 0.45±0.04①0.84±0.08 1.07±0.09②38.19＜0.001 MMP-9蛋白相對表達量0.94±0.08 0.52±0.05①0.97±0.10 1.22±0.11②32.60＜0.001細胞遷移數171.16±15.04 105.11±9.86①176.89±16.37 218.03±20.09②26.32＜0.001細胞侵襲數139.04±12.37 107.35±9.67①134.12±12.67 159.31±14.94②8.71＜0.001

圖3 蛋白質印跡法檢測miR-133a轉染處理的T24細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達

2.4 anti-miR-133a可以逆轉黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響與黃芪+anti-miR-NC組相比，與黃芪+anti-miR-133a組miR-133a相對表達水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平升高，細胞遷移和侵襲數量升高（P＜0.05），見圖4，5；表4。

表4 anti-miR-133a可以逆轉黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響∕

表4 anti-miR-133a可以逆轉黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響∕

注：MMP-2為基質金屬蛋白酶2，MMP-9為基質金屬蛋白酶9。

組別黃芪+anti-miR-NC黃芪+anti-miR-133a t值P值重復次數3 3 miR-133a相對表達量1.00±0.11 0.48±0.03 4.56＜0.001 MMP-2蛋白相對表達量0.34±0.03 0.80±0.06 6.86＜0.001 MMP-9蛋白相對表達量0.42±0.04 0.86±0.08 4.92＜0.001細胞遷移數84.67±8.31 167.04±15.46 4.69＜0.001細胞侵襲數76.39±7.14 128.49±11.66 3.81＜0.001

2.5 AG490可以逆轉anti-miR-133a聯合黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響與黃芪+anti-miR-133a組 相 比，黃 芪+anti-miR-133a+AG490組p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平降低，細胞遷移和侵襲數量降低（P＜0.05），見圖6，7；表5。

表5 AG490可以逆轉anti-miR-133a聯合黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響

表5 AG490可以逆轉anti-miR-133a聯合黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響

注：p-JAK1為磷酸化Janus激酶1，p-STAT6為磷酸化信號轉導和轉錄激活因子6，MMP-2為基質金屬蛋白酶2，MMP-9為基質金屬蛋白酶9。

組別黃芪+anti-miR-133a黃芪+anti-miR-133a+AG490 t值P值重復次數3 3 p-JAK1蛋白相對表達量0.50±0.04 0.26±0.02 5.37＜0.001 p-STAT6蛋白相對表達量0.32±0.03 0.12±0.01 6.33＜0.001 MMP-2蛋白相對表達量0.80±0.06 0.38±0.03 6.26＜0.001 MMP-9蛋白相對表達量0.88±0.08 0.48±0.05 4.24＜0.001細胞遷移數量162.01±15.24 96.83±9.02 3.68＜0.001細胞侵襲數量123.57±10.02 90.55±8.76 2.48＜0.001

3 討論

腫瘤轉移是臨床治療失敗的主要原因，尋找抗侵襲、抗轉移的藥物是提高腫瘤治療成功的關鍵，而中醫(yī)藥在抗腫瘤方面具有獨特的優(yōu)勢，積極探討中醫(yī)藥預防腫瘤的侵襲和轉移機制，努力開發(fā)中藥資源具有重要意義［10-11］。研究表明黃芪具有抗腫瘤功效［12］。如黃芪注射液可抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移，并促進細胞凋亡［13］。黃芪多糖可抑制卵巢癌細胞的生長［14］。黃芪多糖抑制非小細胞肺癌細胞H1299的遷移和侵襲［15］。以上研究結果表明黃芪及其有效成分可通過調控miRNA或信號通路抑制腫瘤的生長和轉移。然而黃芪對膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響尚不清楚，為研究黃芪對膀胱癌細胞的有影響，本研究用不同濃度的黃芪處理膀胱癌細胞T24，結果顯示，黃芪處理的膀胱癌細胞T24中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低，細胞遷移和侵襲數量降低，說明黃芪可抑制膀胱癌細胞T24遷移和侵襲。

圖5 蛋白質印跡法檢測anti-miR-133a處理的T24細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達

圖7 蛋白質印跡法檢測AG490處理的T24細胞p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白的表達

此外，本研究還發(fā)現黃芪處理的膀胱癌細胞T24中miR-133a表達水平升高，說明黃芪可以上調miR-133a的表達，與文獻［9］研究結果相符。且有研究表明miR-133a在膀胱癌中下調表達［16］。lncRNA XIST通過靶向下調miR-133a可促進膀胱癌細胞的增殖和遷移［17］。為研究黃芪對膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲影響的機制是否與miR-133a有關，本研究檢測了黃芪處理的膀胱癌細胞T24中miR-133a表達水平，結果顯示，黃芪可以上調miR-133a的表達。本研究還證實了過表達miR-133a可抑制膀胱癌細胞T24遷移和侵襲；而抑制miR-133a表達可促進膀胱癌細胞T24遷移和侵襲。與前人研究結果相符。為進一步研究黃芪是否通過影響miR-133a表達影響膀胱癌細胞，本研究抑制miR-133a表達的同時用黃芪處理T24細胞，結果顯示，抑制miR-133a表達逆轉了黃芪對T24細胞遷移和侵襲的抑制作用。提示，黃芪可能通過調控miR-133a的表達影響膀胱癌細胞T24遷移和侵襲。

JAK∕STAT信號通路參與多種實體腫瘤的發(fā)生及轉移［18］。研究報道激活JAK2∕STAT3途徑可誘導膀胱癌細胞的遷移和侵襲［19］。黃芪多糖通過抑制JAK∕STAT3信號通路可抑制口腔鱗癌細胞SCC-25裸鼠移植瘤的生長［20］。為研究黃芪是否通過JAK∕STAT3信號通路影響膀胱癌細胞的遷移和侵襲，本研究檢測了黃芪處理的膀胱癌細胞T24中JAK∕STAT3信號通路相關蛋白的表達，結果顯示，p-JAK1、p-STAT6蛋白相對表達水平降低，表明黃芪可能抑制JAK1∕STAT6信號通路激活。且本研究還發(fā)現抑制miR-133a表達逆轉了黃芪對JAK1∕STAT6信號通路的抑制作用。表明黃芪可能通過miR-133a影響JAK∕STAT信號通路，為進一步研究JAK∕STAT信號通路與黃芪及miR-133a的關系，本研究用JAK-STAT3信號通路的阻滯劑AG490處理抑制miR-133a表達聯合黃芪作用的T24細胞，結果顯示，p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低，細胞遷移和侵襲數量降低；說明阻滯JAK∕STAT信號通路可以逆轉抑制miR-133a表達聯合黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響。

綜上所述，黃芪可能通過上調miR-133a表達抑制JAK∕STAT信號通路抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。為臨床治療膀胱癌提供了參考及可能的分子作用靶點。

（本文圖4，6見插圖1-3）

圖4 anti-miR-133a逆轉黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響（結晶紫染色×200） 圖6 AG490逆轉anti-miR-133a聯合黃芪對T24細胞遷移和侵襲的影響（結晶紫染色×200）