丹參素對(duì)糖尿病腎病大鼠Notch1/免疫球蛋白κJ區(qū)重組信號(hào)結(jié)合蛋白/Msh同源異型基因2信號(hào)通路及鈣磷代謝的影響

陳霞，米愛(ài)紅，秦麗

糖尿病腎病屬糖尿病引起的慢性微血管并發(fā)癥之一，臨床上表現(xiàn)為尿蛋白和腎功能衰退［1］；骨代謝、礦物質(zhì)紊亂代謝綜合征是終末期腎臟疾病的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為鈣、磷水平異常，而鈣、磷水平異?？商岣哐茆}化率，是骨質(zhì)疏松形成的途徑之一，增加腎臟誘發(fā)骨病的風(fēng)險(xiǎn)，不利于治療［2］。減少糖尿病腎病的并發(fā)癥對(duì)于治療疾病意義重大。丹參素對(duì)心血管具有保護(hù)作用，可作為一種鈣拮抗劑有效抑制鈣內(nèi)流，從而抑制血管鈣化［3］，但具體作用機(jī)制尚不清楚。Notch1∕免疫球蛋白κJ區(qū)重組信號(hào)結(jié)合蛋白（RBP-Jκ）∕Msh同源異型基因2（Msx2）信號(hào)通路與血管鈣化有明顯的相關(guān)性［4］，丹參素是否影響Notch1∕RBP-Jκ∕Msx2信號(hào)通路從而影響糖尿病腎病鈣磷代謝而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)高糖高脂、鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病腎病大鼠模型，探究丹參素對(duì)糖尿病腎病大鼠鈣磷代謝的影響，并探討其初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2019年10月至2020年4月，健康SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司［SPF級(jí)，許可證號(hào)SCXK（京）-2018-0017］，體質(zhì)量（210±10）g。河南省直第三人民醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心暫養(yǎng)，溫度（24±1）℃、光照∕黑暗（12 h∕12 h）常規(guī)飼養(yǎng)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 試劑與儀器丹參素（西安清樂(lè)生物科技有限公司，批號(hào)090208，純度≥98%）；STZ（美國(guó)sigma公司，批號(hào)S0131）；格列喹酮片（糖適平，北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)H10940258）；24 h尿微量白蛋白（microalbuminuria，mALB）試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)SBJ-R0088）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海生工生物技術(shù)公司，批號(hào)E607318）；Von Kossa染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)G3282）；一抗兔源Notch1、RBPJκ、Msx2、Jagged1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、二抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔（英國(guó)abcam公司）；一抗兔源Notch1基因的胞內(nèi)域（N1ICD，美國(guó)Bioworld公司）。血糖儀（強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司，型號(hào)UltraVue）；全自動(dòng)生化分析儀（日本Toshiba公司，型號(hào)TBA-40ER）。

1.3 動(dòng)物分組及給藥處理所有大鼠實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)尿蛋白、血糖水平。高糖高脂飼料各組分比例：膽酸鈉0.1%、豬油10%、基礎(chǔ)飼料61.9%、蔗糖20%、蛋黃粉8%。參照文獻(xiàn)［5］構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，高糖高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周，禁食12 h后腹腔注射40 mg∕kg STZ，72 h后采集尾靜脈血檢測(cè)血糖水平，若空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥16.70 mmol∕L，即為造模成功。選擇造模成功大鼠50只，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、丹參素（低、中、高）劑量組、糖適平組，每組10只；對(duì)照組（n=10）基礎(chǔ)飼料正常飼養(yǎng)相同時(shí)間，禁食12 h后腹腔注射等體積0.1 mol∕L檸檬酸鹽緩沖液。丹參素（低、中、高）劑量組灌胃2.5 mL·kg-1·d-1、5.0 mL·kg-1·d-1、10.0 mL·kg-1·d-1丹參素，糖適平組灌胃9.45 mL·kg-1·d-1糖適平，對(duì)照組、模型組灌胃等體積蒸餾水，1次∕天，連續(xù)4周。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束觀察大鼠一般情況實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察各組大鼠精神狀態(tài)，活動(dòng)量情況，機(jī)體反應(yīng)、飲食飲水、排尿量情況。

1.5 血糖儀檢測(cè)FBG水平在給藥前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物禁食不禁水，尾靜脈采血，血糖儀檢測(cè)FBG水平。

1.6 24 h尿mALB試 劑 盒 檢 測(cè)24 h尿mALB水平在給藥前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物禁食不禁水，收集24 h尿液，離心取上清，按照24 h尿mALB試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中24 h尿mALB水平。

1.7 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中鈣、磷水平給藥后尾靜脈取血，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中鈣、磷水平。鈣×磷（mg2∕dL2）=鈣（mmol∕L）×4×磷（mmol∕L）×3.1。

1.8 HE檢測(cè)大鼠腎臟組織形態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，尾靜脈取血后立即處死大鼠，剖開(kāi)腹腔取出腎臟，部分置于4%多聚甲醛固定后制備石蠟切片，蘇木精染色、伊紅復(fù)染，顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)。部分置于-80℃冰箱保存待檢；同時(shí)剪取脊柱旁腎主動(dòng)脈血管置于4%多聚甲醛固定。

1.9 Von Kossa染色檢測(cè)大鼠腎主動(dòng)脈鈣鹽沉積情況4%多聚甲醛中取出腎主動(dòng)脈，制備石蠟切片，5%硝酸銀浸染，5%硫代硫酸鈉處理，0.5%伊紅浸染，顯微鏡下觀察腎主動(dòng)脈鈣鹽沉積情況。黑色顆粒為鈣鹽沉積。

1.10 蛋白免疫印跡檢測(cè)大鼠腎臟組織中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平-80℃冰箱中取腎臟組織，添加蛋白裂解液冰上研磨，10 000g4℃離心20 min，上清即為總蛋白。相同蛋白量上樣、凝膠電泳分離轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉；分別加入一抗Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD、GAPDH，4℃孵育過(guò)夜；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用xˉ±s表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參素對(duì)大鼠一般情況影響對(duì)照組大鼠正常飲食、飲水，精神狀態(tài)良好；模型組大鼠精神萎靡、活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍、眼神無(wú)力，多飲多食、排尿量增加、墊料易潮濕；丹參素低劑量組癥狀稍優(yōu)于模型組，但仍出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、雙目無(wú)神，多飲多食、排尿量增加，墊料易潮濕；丹參素（中、高）劑量組、糖適平組情況緩解，活動(dòng)基本正常，反應(yīng)稍遲鈍，但仍多飲多食、排尿量增加、墊料易潮濕。

2.2 丹參素對(duì)FBG、mALB的影響給藥前，與對(duì)照組相比，模型組、丹參素（低、中、高）劑量組、糖適平組FBG、24 h尿mALB水平升高（P＜0.05）。給藥后，與對(duì)照組相比，模型組FBG、24 h尿mALB水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，丹參素低劑量組24 h尿mALB水平，丹參素（中、高）劑量組、糖適平組FBG、24 h尿mALB水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠空腹血糖（FBG）、24 h尿微量白蛋白（24 h尿mALB）水平比較

表1 大鼠空腹血糖（FBG）、24 h尿微量白蛋白（24 h尿mALB）水平比較

注：①與對(duì)照組相比，P＜0.05。②與模型組相比，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹參素低劑量組丹參素中劑量組丹參素高劑量組糖適平組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 FBG∕（mmol∕L）給藥前6.73±0.52 19.48±3.18①19.56±3.59①19.83±3.44①20.06±3.61①19.98±3.19①29.27＜0.001給藥后7.09±0.98 20.35±3.73①17.56±3.15 16.34±3.86②16.18±3.15②16.29±3.18②20.13＜0.001 24 h尿mALB∕（mg∕L）給藥前22.18±3.95 60.76±5.93①59.48±6.17①60.98±5.76①60.37±6.14①60.33±5.79①75.61＜0.001給藥后22.81±4.17 101.38±13.15①77.86±7.14②51.48±6.95②47.29±5.37②64.75±6.18②123.35＜0.001

2.3 丹參素對(duì)大鼠腎臟組織形態(tài)的影響對(duì)照組大鼠腎臟組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰；模型組出現(xiàn)腎小球肥大、基膜增厚現(xiàn)象，組織纖維化、炎癥浸潤(rùn)明顯；丹參素低劑量組腎小球肥大、基膜增厚現(xiàn)象明顯，組織纖維化、炎癥現(xiàn)象明顯；丹參素中劑量組腎小球肥大、基膜增厚緩解，組織纖維化消失、炎癥緩解；丹參素高劑量組和糖適平組腎臟組織形態(tài)基本正常，無(wú)組織纖維化、炎癥現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

2.4 丹參素對(duì)大鼠腎主動(dòng)脈血管鈣化的影響對(duì)照組腎主動(dòng)脈血管正常；模型組腎主動(dòng)脈血管內(nèi)膜、中膜彈性纖維間出現(xiàn)大量黑色顆粒，血管鈣化嚴(yán)重；丹參素低劑量組腎動(dòng)脈血管內(nèi)膜、中膜彈性纖維間出現(xiàn)黑色顆粒，但相對(duì)模型組減少，血管鈣化稍緩解；丹參素中劑量組腎主動(dòng)脈血管內(nèi)膜出現(xiàn)黑色顆粒，中膜彈性纖維間黑色顆粒減少，血管鈣化緩解；丹參素高劑量組和糖適平組血管內(nèi)膜、中膜彈性纖維間顆粒明顯減少，血管鈣化緩解。見(jiàn)圖2。

2.5 丹參素對(duì)大鼠血清中鈣、磷水平的影響與對(duì)照組相比，模型組血清中鈣、磷、鈣×磷升高（P＜0.05）；與模型組相比，丹參素（低、中、高）劑量組、糖適平 組 血 清 中 鈣、磷、鈣×磷 降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 大鼠血清中鈣、磷、鈣×磷水平比較

表2 大鼠血清中鈣、磷、鈣×磷水平比較

注：①與對(duì)照組相比，P＜0.05。②與模型組相比，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹參素低劑量組丹參素中劑量組丹參素高劑量組糖適平組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 10鈣∕（mmol∕L）2.24±0.09 2.89±0.14①2.74±0.11②2.63±0.08②2.46±0.09②2.64±0.07②51.77＜0.001磷∕（mmol∕L）2.49±0.21 3.48±0.28①3.14±0.29②3.01±0.25②2.78±0.18②3.02±0.22②19.14＜0.001鈣×磷∕（mg2∕dL2）71.06±13.48 126.29±13.16①106.73±12.57②96.18±10.33②84.83±8.18②97.96±9.18②27.63＜0.001

2.6 丹參素對(duì)大鼠腎臟組織Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平的影響與對(duì)照組相比，模型組腎臟組織中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，丹參素低劑量組腎臟組織中Notch1，RBP-Jκ、N1-ICD蛋白水平降低，丹參素（中、高）劑量組、糖適平組腎臟組織中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3，表3。

表3 大鼠腎臟組織中Notch1，RBP-Jk，Msx2，Jagged1、N1-ICD蛋白水平比較

表3 大鼠腎臟組織中Notch1，RBP-Jk，Msx2，Jagged1、N1-ICD蛋白水平比較

注：RBP-Jκ為免疫球蛋白κJ區(qū)重組信號(hào)結(jié)合蛋白，Msx2為Msh同源異型基因2，N1-ICD為Notch1基因的胞內(nèi)域。①與對(duì)照組相比，P＜0.05。②與模型組相比，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹參素低劑量組丹參素中劑量組丹參素高劑量組糖適平組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 Notch1 0.31±0.06 1.06±0.15①0.94±0.11②0.46±0.08②0.14±0.03②0.15±0.04②202.90＜0.001 RBP-Jk 0.37±0.04 1.15±0.03①1.01±0.06②0.38±0.04②0.08±0.01②0.07±0.02②1 572.59＜0.001 Msx2 0.23±0.04 0.69±0.05①0.64±0.05 0.42±0.04②0.13±0.03②0.14±0.04②345.14＜0.001 Jagged1 0.18±0.04 0.89±0.08①0.83±0.11 0.43±0.08②0.17±0.02②0.23±0.04②226.51＜0.001 N1-ICD 0.24±0.04 1.27±0.21①0.87±0.14②0.36±0.05②0.17±0.04②0.21±0.05②168.17＜0.001

圖3 大鼠腎臟組織中Notch1，RBP-Jκ，Msx2，Jagged1和N1-ICD蛋白水平

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病終末階段，血管鈣化率明顯高于正常同齡人。血管鈣化是鈣磷沉積血管壁，可促進(jìn)高血壓、腎小球囊內(nèi)壓升高，加速腎臟微血管鈣化，從而加速疾病發(fā)展［6］；鈣磷積累導(dǎo)致血管變窄變脆，與心血管事件死亡率相關(guān)，是心血管疾病的危險(xiǎn)因素［7］。本研究首先構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)FBG、24 h尿mALB水平，觀察腎臟組織病理學(xué)形態(tài)改變以驗(yàn)證模型構(gòu)建是否成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，模型組FBG、24 h尿mALB水平升高；大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍、眼神無(wú)力，多飲多食、排尿量增加、墊料易潮濕；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)腎小球肥大、基膜增厚現(xiàn)象，組織纖維化、炎癥浸潤(rùn)明顯，提示模型建立成功。Von Kossa染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎主動(dòng)脈血管內(nèi)膜、中膜彈性纖維間出現(xiàn)大量黑色顆粒，血清中鈣、磷、鈣×磷升高，提示糖尿病腎病大鼠血管鈣化嚴(yán)重，沉積于腎主動(dòng)脈血管處，導(dǎo)致腎小球肥大、基膜增厚，影響病情。

丹參素是從中藥丹參中提取的水溶性酚酸類(lèi)化合物，易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，具有廣泛的藥理作用，可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、減少纖維化、促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞等；同時(shí)可抑制鈣離子內(nèi)流；起抗炎作用，可清除自由基，保護(hù)因鈣離子超載和氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷［8-9］。冠心病中鈣離子負(fù)荷是引起心肌細(xì)胞缺血及再灌注損傷的一個(gè)重要機(jī)制，丹參素可調(diào)節(jié)鈣離子進(jìn)出，減輕鈣離子負(fù)荷，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參素隨著劑量的增加，大鼠活動(dòng)逐漸恢復(fù)正常，反應(yīng)遲鈍減少；腎小球肥大、基膜增厚緩解，組織纖維化消失、炎癥緩解；腎主動(dòng)脈血管內(nèi)膜、中膜彈性纖維間黑色顆粒減少，血管鈣化緩解；血清中鈣、磷、鈣×磷升高。提示丹參素可緩解糖尿病腎病大鼠活動(dòng)減少、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等臨床癥狀，緩解腎臟組織損壞，減少腎主動(dòng)脈血管鈣化情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠的保護(hù)。

Notch1信號(hào)通路屬高度保守信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過(guò)程，參與多種組織器官發(fā)育［11］，同時(shí)參與血管鈣化、骨骼異常改變、癌癥發(fā)生發(fā)展等過(guò)程，其中血管鈣化類(lèi)似于骨形成的主動(dòng)調(diào)節(jié)過(guò)程，與血管鈣化關(guān)系密切［12］。轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ屬Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子，DNA結(jié)合蛋白在哺乳動(dòng)物中成為RBP-Jκ，可識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列從而發(fā)揮功能［13］。Msx2屬肌節(jié)同源框家族一員，存在于充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞交界處，參與細(xì)胞增殖、分化過(guò)程，與心血管、骨骼等組織發(fā)育密切相關(guān)，編碼的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程，從而影響機(jī)體發(fā)育［14］。在腎結(jié)石中存在明顯的鈣化情況，腎臟組織中Msx2水平明顯高于對(duì)照組，Msx2表達(dá)水平可顯示腎結(jié)石的鈣化情況［15］。Jagged1作為Notch1的配體，在血管生成中發(fā)揮重要作用［16］。受體Notch1與相鄰的配體Jagged1結(jié)合可活化Notch信號(hào)通路，活化Notch信號(hào)通路可暴露出N1-ICD，活化的N1-ICD可與RBP-Jκ結(jié)合活化Notch靶基因，Msx2是其中的一個(gè)靶基因，可直接參與血管鈣化過(guò)程［17-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎臟組織中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平升高，提示糖尿病腎病腎臟組織中Notch信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，Notch1與Jagged1結(jié)合后暴露出N1-ICD，N1-ICD結(jié)合RBPJκ促進(jìn)Msx2表達(dá)，促進(jìn)鈣、磷水平升高，鈣、磷過(guò)多在血管中累積，腎血管出現(xiàn)鈣化，鈣化的血管加重疾病進(jìn)程。與模型組相比，丹參素低劑量組腎臟組織中Notch1，RBP-Jκ、N1-ICD蛋白水平降低，丹參素（中、高）劑量組、糖適平組腎臟組織中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平降低，提示丹參素可抑制上述Notch信號(hào)通路從而降低鈣、磷水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟組織保護(hù)。

通過(guò)本研究認(rèn)為丹參素可能通過(guò)Notch1∕RBPJκ∕Msx2信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病大鼠鈣磷異常的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)腎臟的保護(hù)作用。

（本文圖1，2見(jiàn)插圖1-3）

圖1 大鼠腎臟組織形態(tài)（HE染色×400） 圖2 大鼠腎主動(dòng)脈血管鈣化情況（Von Kossa染色×200）