從Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路探討?；撬釋β25-35所致神經(jīng)干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

李婷君，王晶

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種表現(xiàn)為認(rèn)知與記憶功能減退的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白（β-amyloidpeptide，Aβ）異常沉積形成老年斑（senile plaque，SP）沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）和神經(jīng)元丟失等是其主要病理表現(xiàn)［1］。AD發(fā)病機(jī)制目前主要認(rèn)為與Aβ沉積、tau過度磷酸化、神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激等有關(guān)。其中Aβ沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病的始動因素與重要環(huán)節(jié)，認(rèn)為Aβ異常沉積形成的老年斑可誘發(fā)tau蛋白異常磷酸化，并造成神經(jīng)元纖維纏結(jié)與突觸丟失等級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡及突出丟失引發(fā)臨床癥狀［2-3］。成體哺乳動物腦內(nèi)被證實(shí)存在神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs），促進(jìn)其增殖、遷移，并且向神經(jīng)元分化產(chǎn)生神經(jīng)功能，被認(rèn)為是修復(fù)神經(jīng)功能損傷的有效途徑。然而由于AD病人腦內(nèi)Aβ的異常沉積造成了大量神經(jīng)元凋亡及突觸丟失，該途徑被抑制，因此尋找有效手段促進(jìn)NSCs增殖并向神經(jīng)元分化，補(bǔ)充丟失的神經(jīng)元并恢復(fù)神經(jīng)功能被認(rèn)為是治療AD的新希望［4］。NSCs的增殖、分化受機(jī)體多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同調(diào)控，其中Janus激酶2∕信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2∕STAT3）信號通路在NSCs增殖與分化過程中發(fā)揮了重要作用［5］。

?；撬崾且环N游離氨基酸之一，具有保護(hù)視力、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種生理作用。此外?；撬徇€具有神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用［6］。有研究表明，?；撬峥纱龠M(jìn)缺氧缺糖誘導(dǎo)的NSCs向神經(jīng)元分化［7］。但是其對AD模型NSCs的增殖與分化的影響尚未見報(bào)道。因此本研究以Aβ25-35誘導(dǎo)NSCs損傷復(fù)制AD-NSCs模型，觀察?；撬釋D-NSCs的增殖、分化及凋亡的影響，并通過AK2∕STAT3信號通路分析探討分子機(jī)制。

本研究自2019年3月至2019年11月通過Aβ25-35損傷從新生小鼠腦內(nèi)提取的神經(jīng)干細(xì)胞，建立AD體外模型，探討牛磺酸和JAK2∕STAT3的作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物C57BL∕6小鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量范圍22～27 g，8～10周齡，購買于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（遼）2019-0001。每只鼠籠內(nèi)放置1只雄鼠和1只雌鼠，使其自然繁殖。動物實(shí)驗(yàn)在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，滿足實(shí)驗(yàn)動物3R原則。本研究符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)，恒溫20～25℃，恒濕55%～65%，自由飲用食水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑?；撬幔绹鳶igma公司，批號6730-83-2），NSCs專用培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司，批號T202026D501）；Aβ25-35多肽（北京博奧森生物科技有限公司，貨號Y-0044）；CCK-8試劑盒（北京碧云天生物有限公司，貨號C0037）；EDU試劑盒（Invitrogen公司，貨號A10044）；B細(xì)胞淋巴瘤∕白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-3（caspase-3）及β-肌動蛋白（β-actin）引物購于北京賽諾科為生物科技有限公司；巢蛋白（Nestin）、胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白（Sox-2）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、神經(jīng)元核抗原（NeuN）、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（OLIG-2）、總Janus激酶2（t-JAK2）、總信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（t-STAT3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、p-STAT3及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號33475S、2748S、80788T、24307S、52635S、3230S、66245S、12640T、9145S、5174S）；Cy3、FITC標(biāo)記二抗（美國Jackson公司，貨號147259、147301）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物公司，批號201902433）；RevertAidTM cDNA合成試劑盒、TRIzolTM試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批 號20180914、20170621）；TransStart?Top Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號2019010123）；二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0012S、P0018FS），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器HCP-168型細(xì)胞培養(yǎng)箱（青島海爾）；Ti-S型熒光顯微鏡（日本尼康）；7500型Real-time PCR儀（美國ABI）；MR96型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞）；1645050水平核酸電泳儀、1658001蛋白轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定取新生48 h內(nèi)乳鼠的腦室下區(qū)和海馬區(qū)組織，剪碎、0.25%胰酶消化20 min，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，除去大細(xì)胞團(tuán)，得到細(xì)胞懸液，過200目細(xì)胞篩網(wǎng)，并接種于24孔板中（接種密度5×109個(gè)∕L），置于37℃、5%二氧化碳-95%空氣的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天時(shí)進(jìn)行半量換液，細(xì)胞逐漸以懸浮的NSCs球形式進(jìn)行生長。細(xì)胞傳代至第三代時(shí)，利用免疫熒光染色進(jìn)行鑒定［觀察神經(jīng)巢蛋白（Nestin）、胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白（Sox-2）陽性表達(dá)情況］。

1.4.2 Aβ23-35寡聚體的制備取Aβ23-351.0 mg溶于六氟異丙醇（HF1P），渦旋后室溫下靜置直至液體澄清。放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥，得到無色透明的Aβ肽膜。向Aβ肽膜內(nèi)加入適量DMSO，得到Aβ-DMSO溶液，加入PBS溶液渦旋混勻后置于4℃內(nèi)孵育24 h，既得到1 mol∕L Aβ23-35寡聚體母液。取適量母液用培養(yǎng)液稀釋至25 μmol∕L，備用。

1.4.3 分組與給藥實(shí)驗(yàn)組分為對照組、模型組（25 μmol∕L Aβ23-35）、Aβ25-35+牛 磺 酸5 mmol組、Aβ25-35+?；撬?0 mmol組、Aβ25-35+?；撬?5 mmol組及Aβ25-35+牛磺酸20 mmol組，共六組［7］。藥物于Aβ25-35孵育12 h后加入，共同孵育48 h后進(jìn)行以下指標(biāo)檢測。

1.4.4 CCK-8檢測細(xì)胞活力將神經(jīng)球打散，接種于96孔板中，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，檢測時(shí)每孔加入20 μL CCK-8染色液繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，置于酶標(biāo)儀中，450 nm處測定吸光度（OD）。細(xì)胞活力%=（OD實(shí)驗(yàn)組∕OD正常組）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 NSCs增殖能力檢測

1.4.5.1 NSCs球半徑的測量分別于給藥后第3、5、7天，將培養(yǎng)板置于顯微鏡下，觀察NSCs球生長情況，Image J分析軟件測量各組神經(jīng)球的半徑，并繪制生長曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5.2 EDU增殖檢測根據(jù)Invitrogen公司ClickiT EDU試劑盒說明書步驟進(jìn)行熒光染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照，利用Image J軟件計(jì)量增殖陽性細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算各組NSCs增殖比率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 免疫熒光染色檢測NSCs分化能力將96孔板中的各組細(xì)胞增殖培養(yǎng)液吸出，加入200 μL含有10%FBS和1%P∕S的DMEM∕F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并相應(yīng)分為對照組、模型組（25 μmol∕L Aβ23-35）、Aβ25-35+?；撬? mmol組、Aβ25-35+牛磺酸10 mmol組、Aβ25-35+牛磺酸15 mmol組及Aβ25-35+?；撬?0 mmol組。7 d后，利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法觀察神經(jīng)元標(biāo)記物神經(jīng)元核抗原（NeuN）、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）與少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（OLIG-2）陽性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.7 Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)將打散的單個(gè)神經(jīng)球按每孔5×106∕mL接種于6孔板中，?；撬岱跤?8 h后利用Trizol試劑提取RNA。按照cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，按TransStart Top Green qPCR SuperMix說明書進(jìn)行體外擴(kuò)增，各基因引物序列見表1。反應(yīng)體系（共20 μL）：cDNA 2 μL、Forward Primer（10 μmol）0.4 μL、Reverse Primer（10 μmol）0.4 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、雙蒸水7.8 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次；72℃再延伸1 min。以β-actin作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

表1 基因引物序列

1.4.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測JAK2∕STAT3信號通路相關(guān)蛋白提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入4倍上樣緩沖液，加熱變性蛋白，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入1∶1 000稀釋的t-JAK2、t-STAT3、p-JAK2、p-STAT3及GAPDH工作液，4℃過夜；加入HRP標(biāo)記二抗工作液（1∶1 000），孵育1 h，采用ECL發(fā)光后顯影定影。Image J分析軟件被用來進(jìn)行灰度值分析，結(jié)果利用目的蛋白比內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，多組之間差異比較采用單因素方差分析，兩組間差異比較采用LSDt檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的鑒定第3代NSCs生長成細(xì)胞球狀，并且經(jīng)過多次傳代后形成的NSCs球差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NSCs球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin與Sox-2，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ?；撬釋D-NSCs的活力及增殖能力的影響與對照組相比，模型組NSCs活力降低（P＜0.05）；而經(jīng)過不同濃度的?；撬岱跤螅琋SCs活力均有不同程度的升高，其中10 mmol?；撬峤M細(xì)胞活力與模型組相比升高最為明顯（P＜0.05）；5 mmol、15 mmol與20 mmol組細(xì)胞活力與模型組相比雖顯著升高（P＜0.05），但是不及10 mmol?；撬崦黠@。通過測量NSCs球半徑觀察不同濃度?；撬釋ζ湓鲋衬芰Φ挠绊懰?，在增殖培養(yǎng)基中加入不同濃度的?；撬幔?、10、15和20 mmol）后NSCs球半徑均有不同程度的增加，各濃度?；撬峤MNSCs球半徑從大到小依次為10 mmol＞15 mmol＞5 mmol＞20 mmol。其中，從第5天開始，10 mmol與15 mmol組NSCs球半徑與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而5 mmol與20 mmol組NSCs球半徑與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖1，表2。

表2 牛磺酸對AD-NSCs活力及半徑的影響

表2 ?；撬釋D-NSCs活力及半徑的影響

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組5 mmol?；撬峤M10 mmol?；撬峤M15 mmol?；撬峤M20 mmol?；撬峤MF值P值細(xì)胞數(shù)∕個(gè)9 9 9 9 9 9半徑∕μm 3 d 70.26±7.11 42.70±3.48①45.28±2.69 43.53±3.79 43.38±3.68 42.65±3.13 70.78 0.068 5 d 86.92±4.21 46.70±2.84 49.73±5.50 53.85±3.31②52.27±3.65②49.09±4.32 125.20 0.003 7 d 111.37±11.98 50.03±5.52 56.73±5.04 67.19±6.34②61.16±5.58②59.09±5.52 87.98 0.003活力∕%100.00 61.25±6.36①74.82±5.14②81.58±7.03②74.32±8.27②69.33±4.36②18.65 0.012

圖1 ?；撬釋D-NSCs半徑的影響（×20）

我們進(jìn)一步利用EDU染色觀察了不同濃度牛磺酸對AD-NSCs增殖能力的影響，結(jié)果10 mmol與15 mmol牛磺酸組增殖NSCs數(shù)量顯著增加，與模型組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而5 mmol與20 mmol組增殖NSCs數(shù)量與模型組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 ?；撬釋D-NSCs增殖能力的影響∕（%

表3 ?；撬釋D-NSCs增殖能力的影響∕（%

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組5 mmol?；撬峤M10 mmol?；撬峤M15 mmol?；撬峤M20 mmol?；撬峤MF值P值細(xì)胞數(shù)∕個(gè)9 9 9 9 9 9增殖細(xì)胞比例78.36±6.72 43.19±3.06①46.95±6.42 56.57±8.11②52.74±7.15②48.57±8.23 10.20 0.005

2.3 牛磺酸促進(jìn)AD-NSCs向神經(jīng)元分化NSCs球打散后培養(yǎng)于分化培養(yǎng)基中，并加入不同濃度的?；撬幔?、10、15和20 mmol）培養(yǎng)7 d后，NSCs分化為不同的神經(jīng)細(xì)胞類型。NSCs分化為3種神經(jīng)細(xì)胞表型，分別為神經(jīng)元（NeuN+），星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP+）和少突膠質(zhì)細(xì)胞（OLIG-2+）。經(jīng)Image J定量分析發(fā)現(xiàn)不同濃度的?；撬峋哂姓T導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化的能力，其中10 mmol組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量最多，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其次為15 mmol組，神經(jīng)元數(shù)量與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余兩組神經(jīng)元數(shù)量與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。并且?；撬?0 mmol與15 mmol能顯著抑制NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 牛磺酸對AD-NSCs分化能力的影響∕（%

表4 ?；撬釋D-NSCs分化能力的影響∕（%

注：NeuN為神經(jīng)元核抗原，GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白，OLIG-2為少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組5 mmol?；撬峤M10 mmol?；撬峤M15 mmol?；撬峤M20 mmol?；撬峤MF值P值細(xì)胞數(shù)∕個(gè)9 9 9 9 9 9 NeuN+22.47±3.63 5.78±1.45①7.93±1.58 12.64±2.12②10.36±1.43②6.68±1.23 26.49 0.003 GFAP+37.74±3.68 65.50±4.58①59.75±6.31 51.49±4.54②54.82±4.59②58.87±7.52 9.59 0.007 OLIG-2+15.39±3.69 17.63±3.18 19.32±5.42 21.38±6.68 18.50±3.62 19.04±2.59 0.70 0.635

2.4 牛磺酸抑制AD-NSCs凋亡相關(guān)基因表達(dá)與對照組相比，模型組NSCs Bax∕Bcl-2比值顯著升高，caspase-3 mRNA表達(dá)也顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而給予不同濃度的?；撬峁餐跤?，Bax∕Bcl-2比值降低，caspase-3 mRNA表達(dá)也降低；5 mmol、10 mmol和15 mmol?；撬峤M與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而20 mmol牛磺酸組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以初步推測在5～20 mmol范圍內(nèi)，10 mmol?；撬釋D-NSCs的保護(hù)作用最顯著，因此后續(xù)機(jī)制研究選用10 mmol?；撬峤M作為研究對象。見表5。

表5 ?；撬釋D-NSCs凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響∕

表5 牛磺酸對AD-NSCs凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響∕

注：Bax為B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤∕白血病-2，caspase-3為胱天蛋白酶-3。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組5 mmol?；撬峤M10 mmol?；撬峤M15 mmol牛磺酸組20 mmol?；撬峤MF值P值細(xì)胞數(shù)∕個(gè)9 9 9 9 9 9 Bax∕Bcl-2 0.58±0.09 1.35±0.11①0.85±0.05②0.77±0.06②0.81±0.12②1.13±0.08 29.44 0.001 caspase-3 1.04±0.09 1.81±0.12①1.68±0.16②1.49±0.09②1.54±0.06②1.72±0.14 17.10 0.001

2.5 牛磺酸抑制JAK2/STAT3信號通路與對照組相比，模型組NSCs中p-JAK2∕t-JAK2、p-STAT3∕t-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而給予10 mmol?；撬岱跤?，NSCs中p-JAK2∕t-JAK2、p-STAT3∕t-STAT3蛋 白 表 達(dá) 顯 著 降低，與模型組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2，表6。

表6 牛磺酸對AD-NSCs中JAK2∕STAT3信號通路活性的影響

表6 ?；撬釋D-NSCs中JAK2∕STAT3信號通路活性的影響

注：t-JAK2為總Janus激酶2，t-STAT3為總信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，p-JAK2為磷酸化JAK2，p-STAT3為磷酸化STAT3，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組10 mmol?；撬峤MF值P值細(xì)胞數(shù)∕個(gè)3 3 3 p-JAK2∕t-JAK2 0.79±0.12 1.71±0.09①1.24±0.14②45.24 0.002 p-STAT3∕t-STAT3 1.12±0.10 1.79±0.13①1.36±0.11②20.93 0.003

圖2 JAK2∕STAT3信號通路相關(guān)蛋白的電泳圖

3 討論

Aβ來自于21號染色體前體APP蛋白，Aβ由APP蛋白經(jīng)過α-水解酶、β-水解酶和γ-水解酶水解，依次釋放Aβ肽和胞內(nèi)小肽，能引發(fā)神經(jīng)元退變、丟失凋亡等損傷作用。其決定毒性的主要部位在第25-35氨基酸序列，即Aβ25-35，其可通過在神經(jīng)細(xì)胞外蓄積，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架改變，造成神經(jīng)損傷。有研究表明，Aβ25-35會導(dǎo)致突觸可塑性障礙，從而損傷學(xué)習(xí)記憶能力［8］。因此Aβ25-35與NSCs共同孵育來建立體外NSCs的AD模型被廣泛認(rèn)可［9］。神經(jīng)元不具有增殖分裂能力，因此其在發(fā)育時(shí)期主要由靜息的NSCs分化而來［10］。成年哺乳動物NSCs在腦內(nèi)分布是存在局限的，主要分布于海馬齒狀回顆粒層下區(qū)（subgranular，SGZ）和側(cè)腦室周邊的室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）這兩個(gè)區(qū)域［11-12］。生理狀態(tài)下，它們處于靜息狀態(tài)，但是在AD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中它們會代償性地被激活，并促進(jìn)其向神經(jīng)元分化以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生，彌補(bǔ)缺損的神經(jīng)組織［13］。然而，由于Aβ沉積可引起線粒體功能障礙而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，還可觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞分化，最終導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少［14］。因此尋求一種能夠促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化的手段至關(guān)重要。

?；撬崾且环N體內(nèi)含量豐富的非必需氨基酸，在新生哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布于大腦皮層、海馬及小腦等區(qū)域，且含量較為豐富，但在成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中?；撬岬乃椒浅５停?5］。在突觸前膜神經(jīng)元，牛磺酸與?；撬崾荏w結(jié)合，引起神經(jīng)元超極化，從而發(fā)揮類神經(jīng)遞質(zhì)樣作用。?；撬徇€能夠通過抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。另有研究證明，?；撬峥蓽p輕神經(jīng)元損傷，并且能夠促進(jìn)NSCs增殖［16-17］。此外，還有研究表明，?；撬峥纱龠M(jìn)腦缺血大鼠NSCs增殖，并促進(jìn)其向神經(jīng)元分化［18］，但是對AD模型NSCs的影響，未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，?；撬崮軌蛟黾覣D-NSCs的活力、增強(qiáng)NSCs增殖能力并促進(jìn)其向神經(jīng)元分化、還可以死抑制ADNSCs促凋亡基因的表達(dá)并增加抗凋亡基因的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用。以上結(jié)果說明了?；撬峥赏ㄟ^促進(jìn)NSCs增殖、抑制其凋亡，并促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化，促進(jìn)內(nèi)源神經(jīng)再生治療AD。此外，從本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出5 mmol、15 mmol?；撬釋D-NSCs的保護(hù)作用均弱于10 mmol，且20 mmol?；撬犸@示出了部分細(xì)胞毒性。?；撬岵皇堑鞍追肿?，不能通過代謝排出細(xì)胞外且降解速率很慢，這可能會造成?；撬嵩诩?xì)胞內(nèi)積蓄過多，產(chǎn)生一系列毒性作用，從而導(dǎo)致出現(xiàn)隨著濃度的增加，保護(hù)作用減弱的現(xiàn)象，但是具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步去驗(yàn)證。

JAK2∕STAT3信號通路在NSCs的增殖與分化過程中起到至關(guān)重要的作用，AD狀態(tài)下釋放的炎癥因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子會激活JAK2，進(jìn)而激活STAT3使其發(fā)生磷酸化并移位至核內(nèi)與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因GFAP啟動子結(jié)合，促進(jìn)NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化［19］。而在機(jī)體發(fā)育時(shí)期，腦內(nèi)JAK2∕STAT3信號通路活性處于抑制狀態(tài)，STAT3磷酸化水平低，可促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元的分化［20］。Wu等［21］發(fā)現(xiàn)清腦益智湯可通過抑制JAK2∕STAT3信號通路活性，抑制NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。Chen等［22］發(fā)現(xiàn)JAK2∕STAT3信號通路參與了妊娠期甲狀腺功能亢進(jìn)癥對胚胎NSCs增殖和維持的過程，并且利用超生理劑量的3，5，3'-L-三碘甲狀腺原氨酸（T3）可通過抑制JAK2∕STAT3信號通路活性，增強(qiáng)了乳鼠腦內(nèi)NSCs的維持與向神經(jīng)元分化的能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD-NSCs中JAK2∕STAT3信 號 通路 被 激活，JAK2、STAT3磷酸化水平顯著升高；而給予?；撬岷驨SCs中JAK2、STAT3磷酸化水平顯著降低，JAK2∕STAT3信號通路被抑制，說明了?；撬峥赏ㄟ^抑制STAT3磷酸化，繼而影響了其與GFAP啟動子結(jié)合，從而抑制了NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，同時(shí)促使其向神經(jīng)元分化。

綜上所述，?；撬峥赏ㄟ^促進(jìn)AD-NSCs增殖及其向神經(jīng)元分化，并減少NSCs凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這種作用在一定程度上可能是通過抑制JAK2∕STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)的，但是具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。