固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)養(yǎng)殖“非藥品”投入品中37種禁限獸藥

張 微，肖 曼張，兵吳，丹 鐘 仕，花黃浩，*鵬，徐媛原，

（1．深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518101；2．廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點實驗室，廣東 深圳 518101）

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)行業(yè)對漁業(yè)投入品的需求越來越大，而目前對漁業(yè)“非藥品”投入品的監(jiān)管則有所缺失?！胺撬幤贰蓖度肫返淖饔脩?yīng)為改良水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，且不會造成養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，但部分投入品卻對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染，給水產(chǎn)品安全及人類健康帶來隱患［1－2］。目前，化學(xué)類水質(zhì)底質(zhì)改良劑、微生物制劑、中草藥制劑、免疫增強劑等漁用非藥品數(shù)量已遠超正規(guī)獸藥成為水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大投入品［3－4］，一些以“國標(biāo)藥品”為主成分的養(yǎng)殖投入品也被包裝成“非藥品”在市場上銷售［5］。有研究報道了水產(chǎn)“非藥品”致螃蟹大批量死亡［6］的事件，對國家產(chǎn)地水產(chǎn)品監(jiān)控中發(fā)現(xiàn)的獸藥殘留陽性樣品進行溯源也證實違禁藥品來自“非藥品”的使用［7］。針對當(dāng)前存在的“非藥品”成分不明、無生產(chǎn)技術(shù)及質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)等問題，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確測定“非藥品”投入品中多種禁限獸藥殘留的方法，以保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全，并進一步提升養(yǎng)殖投入品監(jiān)管監(jiān)測水平。

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法因靈敏度高、準(zhǔn)確度好、基質(zhì)干擾小等優(yōu)勢，是復(fù)雜基質(zhì)樣品快速測定的首選［8－10］。在水產(chǎn)領(lǐng)域，現(xiàn)有研究大多是針對水產(chǎn)品中多種獸藥殘留的檢測［11－14］，對“非藥品”投入品中獸藥殘留的研究較少。本研究針對基質(zhì)復(fù)雜的投入品，重點從色譜條件、質(zhì)譜條件、提取液、萃取方式等方面進行研究論證，最終采用PRiME－HLB固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法對“非藥品”投入品中37種禁限獸藥進行測定。此外，本研究還對市售的170份水產(chǎn)養(yǎng)殖投入品進行了分析檢測，以期為監(jiān)管部門提供數(shù)據(jù)參考，嚴(yán)防假劣投入品流入水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Agilent 1290II超高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX三重四極桿5500質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源）；PL602E百分之一電子天平；MTV－100多管旋渦混合儀；AS30600BDT超聲波清洗儀；Sigma 3－30KS高速冷凍離心機；N－EVAP－24全自動氮吹儀；Waters PRiME－HLB固相萃取柱（6 mL，200 mg）。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純；超純水（Milli－Q超純水儀制得），Mcllvaine－乙二胺四乙酸二鈉（Mcllvaine－Na2EDTA）緩沖溶液（0.1 mol/L）。

分析標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺類（磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺甲基異唑、磺胺二甲異唑、磺胺喹啉、甲氧芐啶、磺胺苯吡唑），酰胺醇類（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考），硝基咪唑類（羥基甲硝唑、甲硝唑、地美硝唑、洛硝噠唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑、甲苯咪唑、5-羥基-甲苯咪唑、替硝唑、奧硝唑、羥基異丙硝唑），苯并咪唑類（氟苯達唑、芬苯達唑砜、噻苯噠唑、阿苯達唑砜），抗病毒類（金剛烷胺）（純度≥92%，德國Dr.Ehrenstorfre公司）。

實際樣品隨機抽樣于廣東省各市水產(chǎn)養(yǎng)殖主要生產(chǎn)區(qū)水產(chǎn)藥品銷售點和互聯(lián)網(wǎng)上經(jīng)營的水產(chǎn)藥品銷售點。抽樣品類包括底質(zhì)改良劑、水質(zhì)改良劑、消毒劑、殺菌殺蟲和殺藻劑、中草藥制劑等“非藥品”共計170份。將固態(tài)、半固態(tài)樣品充分均質(zhì)后備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg按純度折算成100%質(zhì)量的磺胺類、酰胺醇類、硝基咪唑類、苯并咪唑類、抗病毒類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制成1.00 mg/mL的單物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取適量上述單物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20℃下避光保存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.50 g（精確至0.01 g）均質(zhì)試樣于50 mL離心管內(nèi)，加入10 mL 80%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水（含0.2%甲酸）提取液和5 mL Mcllvaine－Na2EDTA緩沖溶液，置于多管旋渦混合儀上，以2 000 r/min渦旋振蕩3 min，使用超聲波清洗儀超聲提取10 min后，用高速冷凍離心機以10 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取3.5 mL上清液直接過Waters PRiME－HLB固相萃取柱，保持1滴/s速度過柱。準(zhǔn)確吸取收集好的濾液2.5 mL至5 mL帶刻度離心管內(nèi)，于40℃水浴下氮氣吹至濾液少于0.5 mL，用復(fù)溶液將殘留液定容至1.00 mL，渦旋振蕩溶解殘留物，過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件色譜柱：BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；流動相：A1為0.1%甲酸水溶液，A2為5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇；流速：0.4 mL/min；進樣量：5.00 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正/負離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5.5 kV（正離子模式），-4.5 kV（負離子模式）；離子源溫度：550℃；氣簾氣壓力（CUR）：241.3 kPa；碰撞氣壓力（CAD）：62.1 kPa；噴霧氣（GS1）、輔助加熱氣壓力（GS2）：379.2 kPa。以子、母離子的豐度比和保留時間定性，以峰面積定量。各禁限獸藥的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 37種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of 37 veterinary drugs

（續(xù)表2）

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為使色譜峰分離且獲得良好峰形，提高目標(biāo)化合物的靈敏度，實驗對流動相體系進行了優(yōu)化。由于在正離子模式下，向流動相中加入適量甲酸或乙酸銨可提高目標(biāo)化合物離子化效率；而負離子模式下，加入甲酸會抑制目標(biāo)化合物的離子化效率。因此，考察了0.1%甲酸水、5 mmol/L乙酸銨溶液、5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）與甲醇或乙腈的不同組合作為流動相時的分離效果。結(jié)果表明，以甲醇為有機相時，各目標(biāo)化合物的響應(yīng)均較乙腈時好，峰形更對稱更尖銳。通過對比，實驗最終確定2個最佳色譜條件：正離子模式采集時，磺胺類、硝基咪唑類、苯并咪唑類、抗病毒類的流動相體系為0.1%甲酸水溶液－甲醇；負離子模式采集時，酰胺醇類的流動相體系為5 mmol/L乙酸銨－甲醇。此時，各目標(biāo)化合物間的分離效果最好，響應(yīng)最高，峰形無拖尾，更對稱。圖1為空白加標(biāo)（10.0 μg/kg）樣品的MRM色譜圖。

圖1 空白加標(biāo)（10.0 μg/kg）樣品的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of a spiked（10.0 μg/kg）blank sample

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取各個藥物的單標(biāo)溶液（100 μg/L），以針泵注射方式單標(biāo)進樣，采用全掃描模式進行掃描，通過質(zhì)荷比和各化合物的相對分子質(zhì)量確定母離子，再對母離子進行打碎掃描獲得各化合物的子離子信息，選取響應(yīng)強度高的子離子作為定量離子和定性離子對。在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下，優(yōu)化各化合物的去簇電壓和碰撞能量，結(jié)果見表2。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化本實驗對比了乙腈、酸化乙腈（含1%甲酸）、80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈水（含0.2%甲酸）、乙酸乙酯對37種目標(biāo)物提取效率的影響。結(jié)果表明，乙酸乙酯對磺胺類藥物的提取效率較低，乙腈對金剛烷胺的提取效率較低，酸化乙腈（含1%甲酸）和80%乙腈水（含0.2%甲酸）對目標(biāo)物的提取效率無顯著差異。從環(huán)保和節(jié)約資源的方面考慮，最終選取80%乙腈水（含0.2%甲酸）作為提取溶劑。

2.3.2 凈化方法的優(yōu)化水產(chǎn)養(yǎng)殖“非藥品”基質(zhì)成分較為復(fù)雜，凈化效果對方法靈敏度有較大影響。QuEChERS法［15－16］與PRiME－HLB固相萃取柱法［17－18］各有優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測，本實驗對比了這兩種方法的凈化效果。實驗中采用的QuEChERS凈化粉中含有50 mg C18、100 mg PSA和500 mg硫酸鎂，采用的Waters PRiME－HLB柱是一款無需活化的固相萃取柱，與傳統(tǒng)柱相比，省去了活化、淋洗、洗脫等步驟，大幅提高了檢測效率。實驗結(jié)果表明，采用QuEChERS法時目標(biāo)化合物的平均回收率為56.6%～130%，其中磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲異唑、甲氧芐啶、甲砜霉素的平均回收率分別僅為56.6%、58.2%、60.5%、63.6%，氯苯達唑、甲苯咪唑的平均回收率均大于120%；而采用PRiME－HLB柱凈化后，各目標(biāo)化合物的平均回收率范圍為71.6%～119%。最終選取Waters PRiMEHLB固相萃取柱進行凈化。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 線性范圍與檢出限以“非藥品”投入品中37種禁限用獸藥零檢出的產(chǎn)品作為空白樣品，添加一系列濃度的各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，制得系列加標(biāo)樣品，按“1.3”方法前處理后供超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定，以各化合物定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果表明，各禁限獸藥均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均不小于0.991。根據(jù)信噪比（S/N）為3計算得到該方法檢測各目標(biāo)化合物的檢出限（LOD），根據(jù)S/N=10計算得到該方法檢測各目標(biāo)化合物的定量下限（LOQ），得到LOD為0.156～1.94 μg/kg，LOQ為0.520～6.47 μg/kg，方法靈敏度較高。

表3 37種獸藥的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Linear relationships，LODs，LOQs，spiked recoveries and relative standard deviations of 37 veterinary drugs

（續(xù)表3）

2.4.2 回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差對空白基質(zhì)進行低、中、高3個水平的加標(biāo)，進行回收率測定，除氯霉素、金剛烷胺的3個加標(biāo)水平為1.00、2.00、6.00 μg/kg外，磺胺類、硝基咪唑類、苯并咪唑類、甲砜霉素、氟苯尼考的3個加標(biāo)水平均為50.0、100、200 μg/kg，每個水平做6次平行，考察Waters PRiMEHLB固相萃取柱作為凈化柱的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。得到不同加標(biāo)水平下的平均回收率為71.6%～119%，RSD為1.2%～15%。該方法的回收率及精密度良好，滿足實驗室質(zhì)量控制的相關(guān)要求。

2.5 實際樣品測定

對隨機購買的170份水產(chǎn)養(yǎng)殖“非藥品”（包括底質(zhì)改良劑、水質(zhì)改良劑、消毒劑、殺菌殺蟲和殺藻劑、中草藥制劑5類）開展檢測，有32個產(chǎn)品檢出藥物，檢出率為18.8%，上述5類藥品的檢出率分別為9.52%、15.4%、10.0%、23.3%、21.4%（圖2）。其中中草藥制劑中有10個產(chǎn)品同時檢出多種磺胺類及酰胺醇類藥物。從檢出品類看，禁用抗病毒類藥物金剛烷胺檢出1次，限用獸藥磺胺類藥物（磺胺甲基異唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹啉、磺胺嘧啶、甲氧芐啶）和酰胺醇類藥物（氟苯尼考、甲砜霉素）為投入品中主要添加的風(fēng)險物質(zhì)，其含量范圍為1.21～6.57×103μg/kg。各檢出藥物的具體名稱、檢出頻次、檢出含量范圍見表4。結(jié)果表明，部分水產(chǎn)養(yǎng)殖投入品中存在非法添加獸藥的情況，應(yīng)加強監(jiān)管。

表4 實際樣品檢測結(jié)果Table 4 Test results of practical samples

圖2 不同類別“非藥品”投入品的檢出情況Fig.2 The detection of different types in“non-pharmaceutical”inputs

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)養(yǎng)殖“非藥品”投入品中37種禁限獸藥（包括磺胺類、酰胺醇類、硝基咪唑類、苯并咪唑類、抗病毒類5類藥物）殘留的分析方法，實現(xiàn)了上述5類獸藥殘留的同時分析，大幅提高了檢測效率。方法穩(wěn)定性好，靈敏度、準(zhǔn)確度高，可為“非藥品”投入品的檢測工作提供有力的技術(shù)支持。