控藻劑對絲狀藻類的藥效評價方法研究進展

翁愛珍，陳俊鵬，陳潤麗，楊婷婷，張有根，徐宗余，黃小威

（寧波三江益農(nóng)化學有限公司，浙江 寧波 315000）

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展和城鎮(zhèn)化進程的不斷加快，人類活動對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響日益加重。藻類是自然水體中的初級生產(chǎn)者，對水體生物多樣性及漁業(yè)生產(chǎn)起重要作用，但部分水體交替更新周期長、自凈能力差，以及人類影響、氣候變化等多種因素使水體內氮、磷等營養(yǎng)物質富集，藻類過量繁殖[1-3]。過度生長繁殖的絲狀綠藻會阻礙水道交通，降低湖泊的娛樂、美學和商業(yè)價值[4-7]，平鋪于沉積物之上形成很厚的絲狀綠藻藻墊，消耗大量的營養(yǎng)物質和氧氣，嚴重影響底棲生物群落[8]。隨著氣溫、水溫的升高，絲狀綠藻類進入衰亡期開始腐爛變質大量死亡，散發(fā)一種惡臭味，腐爛的藻體不僅分泌有害物質，還會致使水底厭氧，透明度顯著下降，生物多樣性指數(shù)降低，水質惡化，生態(tài)失衡，給沉水植物恢復及湖泊管理帶了很大困難[9-13]。

當前控制藻類爆發(fā)的方法主要包括物理法、生物法和化學法?；瘜W法是目前全球使用較多、范圍較廣的控藻方法，具有速度快，不易復發(fā)，范圍廣，可控制等優(yōu)點，是目前小型池塘、湖泊以及養(yǎng)殖基地等一定區(qū)域內最常用的應急控藻措施[14]。化學法中使用控藻劑來控制藻華或藻類種群過度增長是一種常見且相對經(jīng)濟的方法。化學控藻劑種類很多，大致可分為金屬離子控藻劑、光敏物質控藻劑、除草劑以及一些天然化學試劑（化感物質）等，其中銅基控藻劑最為常見[15,16]。較低劑量的控藻劑可以減輕對生態(tài)系統(tǒng)的影響，降低沉積物中銅負荷和銅沉淀的風險，節(jié)省時間和金錢，但過低的劑量很難達到預期的防治效果[17,18]。因此，尋找對藻類高效、對非靶標生物低風險的控藻劑是控制周期性發(fā)生藻華的關鍵問題。

目前市場上各種化學控藻劑面臨使用方式不明確、效果良莠不齊、施用量沒有明確范圍等突出問題。一般來說，控藻劑的施用量也應與目標使用地點的水體藻含量有關[19]，控藻劑的使用還要注意其使用目的。使用方法和施用劑量應根據(jù)使用目的、藻的種類、藻類的發(fā)生情況、藻類所處環(huán)境、水質情況、水深等多種因素來定。關于控藻劑的研究結果大多是單一針對某一方面的實驗結果，沒有相同的對比。在實際應用中，由于各方面原因，化學控藻劑的選擇比較困難，用量也模糊不清。通過標準化的實驗測試，評估不同控藻劑實際應用效果勢在必行。

本文通過綜述防控水體絲狀藻類的藥效評價方法，可為水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)業(yè)種養(yǎng)殖、環(huán)保部門和科研試驗單位制定室內和野外藥效試驗方法準則及相關標準提供參考依據(jù)。

1 絲狀藻華的藥效評價方法

水體中常見的絲狀藻類包括綠藻門的水綿屬Spirogyra、雙星藻屬Zygnema、轉板藻屬Mougeotia、水網(wǎng)藻屬Hydrodictyon、剛毛藻屬Cladophora、毛枝藻屬Stigeoclonium、鞘藻屬Oedocladium、滸苔屬Enteromorpha；藍藻門的席藻屬Phormidium、鞘絲藻屬Lyngbya；黃藻門的黃絲藻屬Tribonema[20]。研究發(fā)現(xiàn)，不管是用于觀賞的水體池塘[21,22]、漁業(yè)水體[23-25]，還是海洋水體中[26]都出現(xiàn)了絲狀藻藻華泛濫的現(xiàn)象，產(chǎn)生的不良影響日漸嚴重。關于控制絲狀藻藥物的研究較少，例如蝦稻田水綿的防控一般局限于個別藥物的研究，如硫酸銅[27,28]，大量藥物的篩選研究鮮見報道，因此，關于藥物篩選的方法與模型，沒有統(tǒng)一規(guī)范的標準。在絲狀藻研究中對藥劑防效的評價方法不盡相同，主要包括覆蓋面積評價法、生物量評價法、葉綠素a 含量評價法以及葉綠素a 總量評價法。

1.1 覆蓋面積評價法

絲狀藻類防效評估中，表面覆蓋度是運用最為廣的防效評價手段。該法可以直觀看到藥劑對藻類的作用效果，可通過藻類顏色失綠黃化、沉降以及降解等生長狀況評價防效。覆蓋度根據(jù)田間水綿發(fā)生程度（覆蓋度薄厚、點片、連片、成網(wǎng)及清晰度等）分為0～9 級[29]：0 級（無水綿）；1 級（覆蓋面積1%～10%，稍有水綿）；3 級（覆蓋面積11%～25%，水綿輕微發(fā)綠）；5 級（覆蓋面積26%～50%，視野可見水綿）；7 級（覆蓋面積51%～75%，水綿結網(wǎng)）；9 級（覆蓋面積76%～100%，水綿遍布）[30,31]。根據(jù)級數(shù)計算覆蓋度防效，如公式（1）所示。

劉桂英等[30]通過覆蓋面積評價法對45%苯乙錫·錳鋅、20%乙酸銅可濕性粉劑和熟石灰等7 種藥劑的防效進行評價；其中西草凈采用毒土法施藥，熟石灰直接撒施，其他藥劑均使用噴霧法施藥防治稻田水綿的試驗。在施藥3～40 d 內調查藥效5 次，通過目測覆蓋度得出防效，結果顯示處理40 d 后45%三苯基乙酸錫、46%苯乙錫·硫酸銅、96%硫酸銅和25%西草凈藥效仍保持在94%以上。這4 種藥劑不僅藥效持久穩(wěn)定，且對水稻安全。楊微等[31]也使用此法評價藥劑防效，采用毒土法施用15%西草凈可濕性粉劑和80%苯噻酰草胺-吡嘧磺隆-西草凈水分散粒劑來防治水稻田水綿。根據(jù)目測水綿發(fā)生危害程度用覆蓋面積估計來進行防效評價，結果顯示水綿覆蓋面積小于25%時，西草凈或80%苯噻酰草胺·吡嘧磺隆·西草凈均可防治；水綿覆蓋面積大于25%時，施用一定劑量的西草凈，既可有效控制水綿又對水稻安全。使用不同方法和施用不同藥劑防治移栽水稻田、荷塘等地中的水綿，同樣采用覆蓋面積法評價藥劑防治效果[29,32,33]。Welch 等[34]在研究腐爛的大麥秸稈是否能降低運河絲狀藻類的生長試驗時也曾采用目測法，只是評估了絲狀藻類的覆蓋度和生長，但沒有使用分級，結果顯示秸稈上下段藻類生長量在視覺上沒有明顯差異。

覆蓋面積評價法適用于室外環(huán)境下藥效的評估，可以直觀看到藥劑的效果，估計方法快速、簡單，可以大大減少工作量，但對于水下藻類的死亡情況無法評價。該方法評價方式較粗糙，分級結果受個體目測差異影響較大。

覆蓋度防效公式如下：

式中：E—抑制率，%；CK—對照的目標藻類平均級數(shù)；Dt—處理的目標藻類平均級數(shù)。

1.2 生物量評價法

根據(jù)農(nóng)藥田間藥效試驗準則（一）除草劑防治水稻田雜草中雜草的調查方法，根據(jù)絲狀藻類本身生長特性，無法使用株數(shù)進行調查，因此選用生物量法（鮮/干重）和覆蓋面積法作為評價指標，其中生物量法滿足該標準中絕對值調查法和估計值調查法，適用范圍更廣。鮮/干重法具體操作過程：每瓶放置鮮重相等的絲狀藻，藥劑處理后將剩余的絲狀藻用尼龍布過濾，再進行脫水稱得鮮重，最后置于105℃烘箱內烘干至恒重后稱得干重，最后根據(jù)公式（2）計算其防效。

韓軍等[29]研究25%西草凈可濕性粉劑和20%苯乙錫·銅可濕性粉劑對移栽水稻田水綿的防效，用鮮重差異評價防效。Shao 等[35]在實驗室條件下采用鮮重作為評價絲狀藻類生長指標發(fā)現(xiàn)，銀杏和柳葉提取物對絲狀藻Cladophora sp.的生長有抑制作用，水杉對藻類生長有輕微的促進作用。高偉等[14]以干重評價抑藻率，研究了9 種控藻劑及3 種復配控藻劑室內培養(yǎng)條件下對水綿生長的影響。結果表明，9 種控藻劑對水綿的抑制作用均較差，復配10 mg/L 二氧化氯-敵草隆有一定的抑制效果，抑制率達到51%。Hallingse 和Phlips[36]在實驗室條件下研究三乙醇胺螯合銅Cutrine-Plus 和表面活性劑Cide-Kick Ⅱ對絲狀綠藻Spirogyra communice 和絲狀藍藻Oscillatoria sp.和Lyngbya wollei 的活性影響，5 d 后用干重評價藥物的EC50，發(fā)現(xiàn)添加表面活性劑并沒有提高三乙醇胺螯合銅對絲狀藻類的抑制活性。Murray-Gulde 等[19]用干重作為指標之一研究了三種含銅控藻劑Clearigate、Cutrine-Plus 和硫酸銅對浮游淡水綠藻的殺滅活性，96 h 內能控制半數(shù)藻類的濃度EC50顯示，硫酸銅、Cutrine-Plus 和Clearigate 對每mg 藻類干重的銅負荷量分別為4.2 μg、7.3 μg 和7.9 μg，EC50由小至大依次是：硫酸銅、Clearigate、Cutrine-Plus。Prazukin 等[37]根據(jù)絲狀綠藻在湖泊中區(qū)域的不同，使用干濕重評估生物量體積質量濃度。Webb 等[38]研究豬場厭氧消化廢液中絲狀藻的相關指標時采用生物量評價藻產(chǎn)率。戴晨明等[39]在研究光強及氮濃度對絲狀綠藻雙星藻Zygnema生長及生化組成的影響中，也采用生物量作為評價指標，衡量不同因素對絲狀藻生長的影響。Lu[40]等通過絲狀藻的鮮重差異，評價絲狀藻受到不同外因干擾后，生物量的變化。用生物量法評價藻類生長抑制效果的例子較多[41-44]。

生物量法易于操作，可以評價不同藥劑在單位時間內抑制對藻生長。但不同藥劑的致死機理不同，有些藥劑殺死藻類后藻體并不分解，有些藥劑無法殺死藻類但可以抑制其生長，生物量法無法將兩類藥劑的差異區(qū)分開。

鮮/干重防效的計算公式如下：

式中：E—抑制率，%；CK—對照的目標藻類鮮/干重，g；Pt—處理的目標藻類鮮/干重，g。

1.3 葉綠素a 含量評價法

葉綠素a 是反映浮游植物生物量乃至水體富營養(yǎng)化程度的最直接有效的指標之一[45]。葉綠素是藻類的主要光合色素，常見的是葉綠素a，其含量大約是藻干重的1%～2%，是藻類生物量的重要指標[46]。目前，一般多采用分光光度法測定葉綠素含量[47]。葉綠素提取采用熱乙醇分光光度法[48]測量絲狀藻類的葉綠素a 含量。方法如下：取樣后放入10 mL離心管，加入95%乙醇，超聲波破碎，離心，取上清液，用95%乙醇定容至10 mL，在波長664 nm、649 nm 下測定吸光度，以95%乙醇為空白對照，計算葉綠素a 含量和防效[57]，如公式（3）和公式（4）。

大多數(shù)研究者采用葉綠素a 含量作為控藻劑對絲狀藻類的防效評價指標。廖金花[50]在室內條件下研究了不同濃度的撲草凈對水綿的毒性效應，處理后96 h 測定水綿的葉綠素a 含量以評價藥劑對水綿的防效，結果顯示≤10 mg/L 低濃度撲草凈對水綿生長有促進作用，≥30mg/L 高濃度撲草凈對水綿生長具有抑制作用。高偉[14]在室內條件下采用熱乙醇法測定葉綠素a 含量，以評價控藻劑對水綿的防效。早在1983 年，O’Neal 和Lemni 研究了除草劑西瑪津Simazine 對絲狀藻水綿Spirogyra jurgensii（Kutz）、Pitbopbora oedogonia（Mont.）和Cladophora glomerata（L.）Kutz 生長的影響，葉綠素a 含量的變化被當作藻類對除草劑的反應指標。結果表明，在光照強度為100 μE·m-2·s-1及以下時，藻類暴露在5 μM西瑪津下生長受到顯著的抑制；光照強度為400 μE·m-2·s-1時對水綿的殺滅效果最明顯[51]。后來Gibson 和Welch 都在實驗室培養(yǎng)中研究了大麥秸稈對絲狀藻類的生長抑制作用，使用葉綠素a 含量作為評價指標，結果表明腐爛的大麥秸稈可以降低絲狀藻類的生長速率和明顯減少絲狀藻類的葉綠素a 含量[34,52]。Murray-Gulde 等[19]探究三種含銅控藻劑對淡水綠藻的控藻效果，采用葉綠素a 含量作為測定控藻劑有效性的響應參數(shù)，結果顯示3 天后的EC100由小至大依次分別是CuSO4、Cutrine-Plus和Clearigate。Wersal 等[53]使用螯合銅控藻劑F-30對一般絲狀和浮游藻華進行控效試驗，通過7 d、14 d、21 d 和28 d 后的葉綠素a 含量作為評價藻類生長的指標，實驗結果表明螯合銅控藻劑可以有效控制藻類的生長。Bishop 等[54]研究銅基控藻劑CaptainXTR、Cutrine Ultra 和硫酸銅配方對兩種常見絲狀藻類Lyngbya wollei 和Pithophora varia 的控制效果差異，以葉綠素a 含量作為測定指標之一，CaptainXTR 基于葉綠素a 含量所得結果顯示其對Lyngbya wollei 7 天的EC85為0.78 mg Cu/g，效率最高的是CaptainXTR，其次是Cutrine Ultra 和硫酸銅。對絲狀藻類研究中，用葉綠素a 含量作為藻類參數(shù)評價的案例較多[55-61]。

葉綠素a 含量是一個相對敏感的參數(shù)，用其作為評價法靈敏度高，準確性高，適用范圍廣，通過測定室內外試驗藻類葉綠素a 含量，可以準確評價破壞細胞光合作用的控藻劑。但對篩選僅抑制藻類生長而不破壞細胞葉綠素的控藻劑來講，該法存在一定的局限性。

葉綠素a 含量的計算公式如下：

式中：Ca—藻類葉綠素a 含量，mg/g；A664nm—乙醇萃取液在波長664 處的吸光值；A649nm—乙醇萃取液在波長649 處的吸光值；V—提取液體積，L；W—樣品鮮重，g。

式中：E—抑制率，%；Ca1—對照的葉綠素a 含量；Ca2—處理的葉綠素a 含量。

1.4 葉綠素a 總量評價法

當試驗中藥物及濃度梯度數(shù)據(jù)較多且各藥物作用機理不同，為綜合評價藥物的作用，藻類抑制效果采用試驗結束時葉綠素a 總量來評價。具體操作過程：先用紗布過濾處理后的藻類，離心脫水后稱重（同生物量法）；再測定葉綠素a 的含量（同葉綠素a 含量法）；最后根據(jù)公式（5）和公式（6）計算防效。魏朝輝等[62]在室內條件下研究了工業(yè)殺菌滅藻劑、農(nóng)用除草劑、中草藥殺菌劑、植物生長調節(jié)劑、水生沉水植物浸提液總共36 種藥物對河蟹養(yǎng)殖池塘中青苔的抑殺作用，處理6 天后采用葉綠素a 總量法定量研究了綜合評價青苔抑制率。鄭串[63]使用過氧乙酸和異噻唑啉酮對黃絲藻進行室內外抑制實驗，室內試驗采用葉綠素a 總量來評價對黃絲藻的抑制效果。該實驗結果表明過氧乙酸和異噻唑啉酮配合施用對黃絲藻的防效可達94%以上，其中過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍濃度1.00∶0.60 mg/L為最適比例。國內使用該方法評價藥效的較少，國外暫時沒有相關報導。

相對于其他方法來講，葉綠素a 總量法測定步驟繁瑣，但該方法綜合了生物量法和葉綠素a 含量法的優(yōu)點，彌補了兩種方法中的缺陷。該方法尤其適用于藥物和篩選濃度數(shù)據(jù)多、各藥物作用機理不同、絲狀藻類表現(xiàn)特征不同的情況，可以區(qū)分不同作用機理的控藻劑，從而綜合評價藥效。

式中：G—葉綠素a 總量，mg；M—藻類重量，g；Ca—藻類葉綠素a 含量，mg/g。

式中：E—抑制率，%；G0—空白對照組葉綠素a總量，mg；Gt—藥物處理組葉綠素a 總量，mg。

2 總結與討論

2.1 絲狀藻類評價方法的綜合性

對水綿的研究可以發(fā)現(xiàn)，大部分研究是使用兩種或多種評價方法綜合評價藥效。如高偉[14]通過水綿的干重和葉綠素a 含量評價抑藻率，葉綠素a 含量與干重的變化情況保持一致。韓軍等[29]、孫福華等[41]和朱文達等[44]用水綿覆蓋度和鮮重來評價藥劑對水綿的防效，兩種評價方法所得結果一致。李文玲等[33]通過覆蓋度防效和葉綠素含量變化綜合評價藥劑對水綿的防效，覆蓋度防效結果與葉綠素含量變化結果相吻合。Zhang 等[60]使用葉綠素a 含量測定附著藻類的含量，以濕重作為大型漂浮藻墊子的生物量評價指標。Webb 等[38]研究豬舍廢水中的絲狀綠藻時也使用生物量和葉綠素a 含量進行評價。綜合采用幾種不同的評價手段評價藥效，更能明確藥劑的防治效果。

2.2 絲狀藻類藥效評價方法的選擇性

不同藥物作用機理大型絲狀藻類表現(xiàn)特征均不同，需要有選擇性地采用適當?shù)脑u價方法，得到更準確地試驗結果。如青苔凈防治青苔的作用機理直接與葉綠素a 含量相關。這類藥劑與水綿細胞直接接觸，透過細胞壁和細胞膜進入細胞內破壞其細胞質和細胞核，導致細胞變異和破損，干擾葉綠素的合成，抑制其光合作用和呼吸作用，使其死亡[64,65]，通過葉綠素含量的變化也可以判斷藥劑對青苔的抑制作用[33]。有些藥物如撲草凈對葉綠素a 含量影響不大，卻能控制青苔生物量的增加，抑制青苔生長，殺滅作用不強[63]。這類藥劑對青苔的抑制作用可以通過青苔生物量的變化來衡量。當一種藥劑無法判斷其作用機理時，可選擇采用葉綠素a 總量法進行綜合評估。

2.3 絲狀藻類藥效評價方法的局限性

室內的評價方法與田間的藥效評價方法不完全通用，應根據(jù)室內外試驗對象藻類的特性和應用場景選擇合適的評價方法。使用生物量對絲狀藻類的生長速率、增長率、產(chǎn)藻率、生長抑制率等參數(shù)進行評價，所使用的處理方法不盡相同。鮮重的脫水方法包括用吸水毛巾干燥、濾紙、旋轉干燥機、循環(huán)水真空泵、過濾器抽干甚至自然風干等。這些方法需要根據(jù)所研究絲狀藻種類、場所等因素綜合考慮后，選擇最合適的脫水方法。而干重的處理方法，500℃烘干5 h、90℃烘干24 h、105℃烘干至恒重等干燥方法，根據(jù)藻類性質，在一定溫度下烘干至恒重的誤差較小。葉綠素a 含量法中樣品的處理方法不同，所使用的計算方法也截然不同。在不同溶劑下，每種藻類有相應的計算方程。本研究中的評價方式及其計算公式僅針對絲狀綠藻在95%乙醇提取下的葉綠素a 含量。室內活性試驗的特點為藻體體積小，可操作性強，可以使用生物量、葉綠素a 含量、葉綠素a 總量法進行評價，但覆蓋面積評價法不適用。田間藥效試驗處理面積廣、分布范圍不均，環(huán)境因素影響大，可用覆蓋面積法，操作簡單，數(shù)據(jù)易得。

3 展望

準則中NY/T1155-11[66]中已有關于除草劑防治水稻田水綿的室內活性測定試驗方法，室內試驗藥效主要是根據(jù)葉綠素a 含量進行評價。GB/T17980.40-2000[67]準則涵蓋除草劑對水稻田雜草防除的田間藥效評價，但是，水綿的生長狀態(tài)與雜草不同，單純以表面覆蓋度或生物量來評價不夠準確。雖然目前已有多種評價方法應用于實踐，但每一種評價方法都存在一定的限制條件或因素，在評價控藻劑藥效的過程中，應充分考慮藥劑的作用機理、使用范圍等因素，選擇合適的評價方法或選擇幾種評價方法結合的方式綜合評估控藻劑藥效，以期推進控藻劑產(chǎn)品注冊，為農(nóng)業(yè)有害藻管理和科研工作提供更加可靠的數(shù)據(jù)支撐。