穩(wěn)定同位素比值及礦物元素分析技術(shù)在水產(chǎn)品溯源研究中的應(yīng)用進展

白淑艷，王鐘強，湯施展，黃麗，覃東立，陳中祥，王鵬

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150070；2.河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，河北 石家莊 050035）

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要組成部分，是保障優(yōu)質(zhì)蛋白供給和食物鏈安全的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。隨著人們生活水平的普遍提高，消費者對高質(zhì)量、高品質(zhì)水產(chǎn)品的需求日益增加。水產(chǎn)品的品質(zhì)主要受其生長環(huán)境如氣候、光照、水源等諸多因素的影響，優(yōu)質(zhì)適宜的生長環(huán)境往往能夠產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)良的水產(chǎn)品，如挪威三文魚、陽澄湖大閘蟹、五大連池鳙等。品牌效應(yīng)帶來極高的經(jīng)濟價值，為了追逐更高經(jīng)濟效益，冒牌、貼標(biāo)等虛假銷售現(xiàn)象時有發(fā)生，如“巴沙魚冒充龍利魚”、“洗澡魚”、“洗澡蟹”等，這不僅影響了消費者安全和權(quán)益，也影響了整個食品工業(yè)發(fā)展。從食品安全和質(zhì)量的角度來看，水產(chǎn)品地理來源的核實正在成為消費者、經(jīng)銷商和政府部門關(guān)切的熱點。因此，開發(fā)廣泛、快速、廉價和可靠的水產(chǎn)品溯源方法極為重要。目前水產(chǎn)品的溯源技術(shù)發(fā)展迅速，如穩(wěn)定同位素比率分析[2]、礦物元素分析[3]、色譜、近紅外光譜分析[4]、核磁共振[5]和有機成分指紋分析[6]等技術(shù)，正逐漸成為水產(chǎn)品質(zhì)量安全方向的研究熱點。其中，礦物元素及穩(wěn)定同位素比值分析技術(shù)因能夠反映水產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境特征和自身飲食特征，且具有靈敏度高、可靠性強等優(yōu)點在水產(chǎn)品溯源研究中應(yīng)用廣泛、效果突出。本文通過綜述近十年來穩(wěn)定同位素比值及礦物元素分析在水產(chǎn)品溯源應(yīng)用中的最新研究進展，并對其發(fā)展趨勢進行了展望，以期為水產(chǎn)品溯源研究提供參考。

1 穩(wěn)定同位素比值分析技術(shù)

1.1 穩(wěn)定同位素比值分析技術(shù)原理

質(zhì)子數(shù)相同，中子數(shù)（或質(zhì)量數(shù)）不同的原子（核素）互稱為同位素，包括穩(wěn)定同位素和放射性同位素兩大類。同位素組成常用同位素比值（δ）表示，其表達式定義如下：

式中：R樣品和R標(biāo)準分別表示樣品以及標(biāo)準物質(zhì)中重同位素與輕同位素的豐度比[7]。由于同位素質(zhì)量不同，在各種地球化學(xué)過程中會引起其在不同化合物和物相中的豐度變異，稱為同位素分餾，它是穩(wěn)定同位素分析技術(shù)溯源的基本原理和依據(jù)[7]。穩(wěn)定同位素被稱為天然的生態(tài)記錄器，可以提供關(guān)于水、食物、飲食甚至生產(chǎn)過程中有價值的生物地球化學(xué)信息。因此，水生生物之間同位素比值的差異可以根據(jù)生態(tài)位反映不同的地理種源、飼料類型或生境。目前，常用于水產(chǎn)品溯源的同位素包括：δD、δ18O、δ34S、δ13C、δ15N、87Sr/86Sr 和143Nd/144Nd。測定方法包括元素分析儀-同位素比率質(zhì)譜法（Elemental analyzer-isotope-ratio mass spectrometry，EA-IRMS）、熱電離質(zhì)譜法（Thermal ionization mass spectrometry，TI-MS）或多接收器電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Multi-collector inductively coupled plasma mass spectrometry，MC-ICP-MS）等。

1.2 穩(wěn)定同位素比值分析技術(shù)在水產(chǎn)品溯源中的應(yīng)用

表1 為應(yīng)用穩(wěn)定同位素分析對水產(chǎn)品溯源的相關(guān)研究。動物組織中δD、δ18O 值通常受環(huán)境因素（如水）和食物（受溫度、降水和地表水）等的影響。相關(guān)研究表明δD、δ18O 值受緯度影響較大，由蒸發(fā)、冷凝和降水引起的δD 和δ18O 的分餾有助于確定地理來源。例如，利用肌肉中的δD 值可以對澳大利亞對蝦（Penaeus orientalis）和進口對蝦進行有效鑒別[13]。C、N 同位素在溯源研究中應(yīng)用較為廣泛，肌肉樣品中的δ13C 和δ15N 值通常受食物、季節(jié)和溫度的影響。采用C、N 同位素比值可將黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）[14]、大西洋鮭、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[15]等野生和養(yǎng)殖群體進行有效區(qū)分。Camin等[16]指出，動物組織中的有機結(jié)合硫可以追蹤棲息地。對底棲生物馬尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）的產(chǎn)地溯源研究[12]表明，δ34S 值比δ18O 和δD 有更好的地域指示性。吳浩等[8]采用表皮、鱗片中的δ13C、δ15N、δ34S 值對法羅群島、挪威、智利、加拿大、澳大利亞的三文魚以及中國虹鱒進行了有效區(qū)分。

表1 基于穩(wěn)定同位素比值分析技術(shù)的水產(chǎn)品溯源研究Tab.1 Research on traceability of aquatic products based on stable isotope ratio analysis technology

與輕質(zhì)同位素不同，放射性同位素在生物地球化學(xué)過程中主要表征地質(zhì)環(huán)境信息且不會被分餾，它能彌補氣候條件相似的情況下輕質(zhì)同位素溯源效果不佳的缺陷[7]。例如，87Sr/86Sr 值可以提供獨特的信息來幫助追蹤水和食品的來源。生物體內(nèi)的87Sr/86Sr 值取決于當(dāng)?shù)氐牡刭|(zhì)條件，不同性質(zhì)的土壤和水中87Sr/86Sr 值通常不一致，據(jù)此可以將不同地區(qū)的生物進行區(qū)分。研究表明，植物和動物的鍶同位素組成與其地理起源的鍶同位素組成有很好的相關(guān)性[17]。對不同產(chǎn)地的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）鍶同位素的分析表明，蟹樣品中的鍶同位素比值和水環(huán)境密切相關(guān)，而與外源飼料相關(guān)性不大[11]。與鍶不同，釹同位素因水團而異，釹同位素比率在海洋環(huán)境中變化很大，主要是通過反映周圍烴源巖的地質(zhì)年齡，因此也作為追蹤地理起源的示蹤劑。目前鍶和銣同位素還未被廣泛的應(yīng)用于水產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源。Won 等[12]對來自朝鮮、韓國和中國的馬尼拉蛤蜊 樣本中δ13C、δ15N、δ18O、δD、δ34S、87Sr/86Sr和143Nd/144Nd 值進行分析，LDA（線性判別分析，Linear discriminant analysis）表明同位素比值能很好的實現(xiàn)三個地區(qū)的產(chǎn)地判別。

2 礦物元素分析技術(shù)

2.1 礦物元素分析技術(shù)原理

礦物元素是生物體內(nèi)基本組成成分之一，是參與生物代謝的重要物質(zhì)，而生物體內(nèi)的礦物元素含量受水、土壤環(huán)境組成以及當(dāng)?shù)丨h(huán)境因素（如降雨、溫度、日照等）的影響[7]。不同地域或水域的礦物元素分布及組成存在差異，導(dǎo)致來自不同產(chǎn)地（生產(chǎn)方式）的生物體內(nèi)礦物元素的含量及組成情況也表現(xiàn)出各自的特征，這種特征性差異可對農(nóng)產(chǎn)品進行有效溯源。隨著電感耦合等離子體質(zhì)譜和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法的廣泛應(yīng)用，水產(chǎn)品中多種礦物元素的同時測定已成為可能，極大的提高了檢測效率，降低了該溯源方法的成本。常用于溯源研究的礦物元素主要有Mn、V、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Pd、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pb、U 等。檢測技術(shù)包括電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法（Inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES）和原子吸收光譜法（Atomic absorption spectrum，AAS）等。

2.2 礦物元素分析技術(shù)在水產(chǎn)品溯源中的應(yīng)用

魚類組織的元素組成與周圍水生環(huán)境之間的相關(guān)性已被證明是長期穩(wěn)定和一致的，且礦物元素在水生生物中的穩(wěn)定性明顯高于有機化合物，因此它們可作為地理分類中重要的標(biāo)記物[18]。魚類整體的常量和微量元素組成在很大程度上與食物、植被或飼料的元素含量有關(guān)。而動植物飼料中元素的含量是生物有效元素從土壤中被調(diào)動的結(jié)果，因此水產(chǎn)品中元素的含量能夠反映地理區(qū)域的整體特征。例如，由于一些堿性金屬（Rb 和Cs）可以很容易地從土壤中遷移出來，不同的地理位置導(dǎo)致這些元素在魚類組織中的富集程度有所差異[19]。其他微量元素，如B 和As，則是由火山和地?zé)峄顒幼匀贿M入水環(huán)境的[20]，因此，它們在水產(chǎn)品組織中的含量可以用來區(qū)分具有特定地球化學(xué)特征的海洋動物。此外，一些主、微量元素如Li、Mg、Ca、Sr、Zn、Mn、Cu 等的濃度受到海相盆地鹽度的嚴格控制，更適于海洋魚類的溯源研究[21]。宋偉等[22]對來自挪威、澳大利亞、智利3 個產(chǎn)地進口大西洋鮭中10 種礦物元素含量進行測試分析，并基于元素Ca、Fe、Cr、As、Al建立了3 個產(chǎn)地的Fisher 判別模型，取得較好的判別效果。

礦物元素分析技術(shù)在甲殼類動物的溯源研究中相對較少，但在棘皮類和軟體類動物的產(chǎn)地或生產(chǎn)方式溯源中發(fā)揮重要作用（表2）。Li 等[23]采用ICP-AES 法分析了來自三個主要出口國（印度、越南和泰國）的蝦樣品中23 種元素的濃度，通過S-LDA（逐步線性判別分析，Stepwise linear discriminant analysis）篩選了其中的特征元素進行產(chǎn)地判別，判別正確率達到83%以上。

表2 基于礦物元素分析技術(shù)的水產(chǎn)品溯源研究Tab.2 Research on traceability of aquatic products based on mineral element analysis technology

利用礦物元素對海參（Apostichopus japonicus）進行產(chǎn)地判別的兩項研究中[28,29]，采用S-LDA 對元素進行分類，并根據(jù)元素在判別中的相對重要性，建立分類模型，取得不錯的效果。在這兩項研究對比中發(fā)現(xiàn)，測量元素的多少并不是影響分類結(jié)果的直接原因。如果冗余或噪聲元素沒有通過適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計來嚴格評估和刪除，那么使用更多元素作為變量構(gòu)建的模型可能不會優(yōu)于其他模型。

值得注意的是，在使用礦物元素進行溯源時，許多必需元素如鈉、鉀、鎂和鈣的攝取，都受到水產(chǎn)品代謝的調(diào)控，導(dǎo)致這些元素與地理來源相關(guān)的潛在變化被生理“噪音”所掩蓋。而與深海相比，沿海水域或淡水系統(tǒng)的成分異質(zhì)性更大，因為靠近人為釋放源導(dǎo)致一些微量和超微量元素被不同程度地引入。此外，受到某些農(nóng)業(yè)實踐或工業(yè)活動的影響，鎳、鋅、砷、鉛、汞和鎘在海岸線上比在深海的濃度要高[8]。因此，在溯源過程中，對不同來源引入的元素要進行更深入的分析和恰當(dāng)?shù)脑u估，使其具有系統(tǒng)性、可識別性和可管理性，并能揭示其地理來源或生產(chǎn)過程，才能使這些元素成為有效的溯源指標(biāo)。

3 礦物元素與穩(wěn)定同位素分析相結(jié)合在水產(chǎn)品溯源中的應(yīng)用

為了實現(xiàn)更準確、更可靠的產(chǎn)地溯源，近年來，許多研究者嘗試將礦物元素與穩(wěn)定同位素分析聯(lián)合使用，對水產(chǎn)品進行產(chǎn)地或生產(chǎn)方式進行溯源，相關(guān)研究匯總見表3。黃麗英等[31]利用礦物元素與穩(wěn)定同位素分析結(jié)合實現(xiàn)了呂泗漁場、舟山漁場、青海漁場及閩南漁場4 個地區(qū)網(wǎng)銷帶魚（Trichiurus lepturus）的產(chǎn)地判別。Carter 等[13]利用多元素來區(qū)分澳大利亞和亞洲國家的對蝦，判別準確率為87%，當(dāng)與同位素相結(jié)合時，判別準確率達到100%。在對養(yǎng)殖和野生蝦樣品進行判別時[32]，穩(wěn)定同位素比率和多元素分析的判別準確率分別為70%和93.5%，而兩種技術(shù)的結(jié)合實現(xiàn)了100%的正確分類。

表3 基于穩(wěn)定同位素與礦物元素相結(jié)合的水產(chǎn)品溯源研究Tab.3 Traceability of aquatic products based on the combination of stable isotopes and mineral elements

利用礦物元素和穩(wěn)定同位素分析結(jié)合多元統(tǒng)計分析，判別來自中國8 個產(chǎn)地的164 只商品蟹的地理來源[42]，結(jié)果表明，基于δ13C、δ15N 值和Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba 含量的SVM（支持向量機，Support Vector Machine）初始判別和外部驗證準確率分別達到100%和97%。根據(jù)δ13C、δ15N、δ18O、δD 比值和礦物元素含量對來自中國青島、大連、東營、秦皇島、福建的海參進行產(chǎn)地溯源時，PLS-DA（偏最小二乘判別分析，Projection to latent structure-discriminant analysis）的總體判別精度達到97.1%，而SIMCA（類類比軟獨立建模，Soft Independent Modeling of Class Analogy）模型能夠達到100%[41]。

大量的研究表明將礦物元素與穩(wěn)定同位素分析聯(lián)合使用，能夠細化地域信息，篩選更具有特征的分析參數(shù)，進而保證分類方法的可靠性。然而，當(dāng)使用礦物元素與穩(wěn)定同位素分析結(jié)合判別野生和養(yǎng)殖鮭魚時，發(fā)現(xiàn)使用礦物元素或穩(wěn)定同位素比率對判別效果影響不大，但訓(xùn)練分類模型所使用的樣本數(shù)量以及所選擇的分類算法都對結(jié)果有很大的影響[36]。因此，分析技術(shù)的準確性和可靠性、分類方法的選取、樣品數(shù)量的多少等因素都會影響水產(chǎn)品產(chǎn)地及生產(chǎn)方式的判別結(jié)果。

4 多變量數(shù)據(jù)分析和機器學(xué)習(xí)

由于水生生物在其水生環(huán)境中元素的存在不僅取決于棲息地的特定地球化學(xué)特征，還可能受到自然（如氣候、水溫、鹽度、年齡和動物性成熟）或人為（即外源污染）來源的其他環(huán)境因素的顯著影響[42]。因此，在進行產(chǎn)地或生產(chǎn)方式的溯源時，需要對整體元素特征進行嚴格評估。研究表明，多元數(shù)據(jù)的高級統(tǒng)計方法將更直接、有效，例如識別相似食物樣本中常見但隱藏的成分特征、處理包含在基本數(shù)據(jù)中的獨立的互補、對立或冗余信息以及定義分類規(guī)則并通過提取有效的重要元素標(biāo)記來簡化分類方法[43]。

對文獻的分析表明，最廣泛使用的方法是主成分分析（PCA）、聚類分析（CA）、偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）、k 近鄰（kNN）、逐步線性判別分析（S-LDA）等。PCA 是一種有價值的統(tǒng)計工具，其目標(biāo)是最大化數(shù)據(jù)中的方差信息，并以盡可能少的成分直觀地顯示。CA 是基于對象/樣本組之間的內(nèi)在相似性，分層聚類分析的結(jié)果以樹形圖的形式呈現(xiàn)。然而，也有替代的數(shù)據(jù)處理方法，如支持向量機（SVM），類類比軟獨立建模（SIMCA）分類回歸樹（CART）和隨機森林（RF）等機器學(xué)習(xí)方法，顯示出巨大的潛力和比傳統(tǒng)方法更大的優(yōu)勢。如對海參[40]和中華絨螯蟹[42]進行產(chǎn)地判別時，前者采用SIMCA的判別效果要優(yōu)于PLS-DA，后者采用SVM的判別效果要優(yōu)于LDA。因此，在對不同種類的水產(chǎn)品進行產(chǎn)地或生產(chǎn)方式的溯源時，應(yīng)嘗試使用多種分類或機器學(xué)習(xí)方法，找到最適宜的方法使判別效果達到最佳。

5 總結(jié)與展望

礦物元素及穩(wěn)定同位素分析技術(shù)在水產(chǎn)品溯源的應(yīng)用中正發(fā)揮重要的作用，然而也有一些局限性。首先，由于樣品制備成本高和設(shè)備價格高，進行穩(wěn)定同位素分析相當(dāng)昂貴，導(dǎo)致諸如鍶、銣等有著較強的地域性的放射性同位素還未被廣泛使用，因此，需要降低同位素分析設(shè)備的成本，以進一步鼓勵在不同于處理食品監(jiān)測的專門實驗室的情況下推廣多元素及同位素分析方法，通過持續(xù)的技術(shù)改進，以及轉(zhuǎn)向逐漸小型化的儀器，可能是今后水產(chǎn)品溯源的一個主要轉(zhuǎn)折點。其次，在統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理方面，PCA 和LDA 得到了更廣泛的應(yīng)用，而一些機器學(xué)習(xí)算法在挖掘數(shù)據(jù)中隱藏著巨大的潛力，卻一直被忽視。另外，在使用兩種技術(shù)分析進行水產(chǎn)品溯源時，應(yīng)考慮環(huán)境因素影響的可能性，如氣候、降水、巖性、周圍的工、農(nóng)業(yè)污染，還需研究地球化學(xué)和氣象特征在水產(chǎn)品系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移規(guī)律。從長遠來看，為了正確識別水產(chǎn)品的地理來源和生產(chǎn)方式，還應(yīng)增加樣本量，建立多年的樣本數(shù)據(jù)庫，確定同位素和礦物元素測量的可重復(fù)性和再現(xiàn)性，為不同地理來源、不同生產(chǎn)方式以及不同種類的水產(chǎn)品生成同位素和礦物元素地圖，來完善水產(chǎn)品可追溯體系。