基于氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠模型評(píng)價(jià)玉米花絲中性多糖的降尿酸作用

苑 麗 艷， 姜 鵬 飛，2， 祁 立 波，2， 傅 寶 尚，2， 林 松 毅，2

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

高尿酸血癥(HUA)的發(fā)生受血尿酸(UA)水平的調(diào)控，當(dāng)機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，腎臟UA排泄不足引起體內(nèi)UA濃度異常增加，高于416 μmol/L 時(shí)，即為高尿酸血癥[1]，會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)、炎癥反應(yīng)及其他代謝性疾病，心血管疾病、急慢性腎病等的患病概率增加[2-3]。由于生活水平的提高以及人們飲食習(xí)慣的變化等，全球越來(lái)越多的人患上HUA，且患者呈現(xiàn)明顯的低齡化趨勢(shì)[4]。目前診治HUA和痛風(fēng)的有效藥物如別嘌呤醇(AP)等均可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的惡性反應(yīng)，甚至死亡[5]。因此尋找具有抗HUA作用且更加安全的活性物質(zhì)意義重大。

玉米花絲資源豐富、來(lái)源廣闊，含有多種有益的生物活性成分，在民間常被煮水后飲用治療腎炎、高血壓、糖尿病等疾病，或與其他藥物配伍使用治療痛風(fēng)[6]。多糖是其最主要的活性成分[7]。研究表明，玉米花絲多糖在利尿、抗糖尿病、降血脂等方面均表現(xiàn)出良好的藥理作用，是一種潛在的功能制劑[8-9]。然而，關(guān)于玉米花絲多糖對(duì)HUA的作用尚未有明確的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以玉米花絲為原料，從中分離純化得到一種中性多糖，利用氧嗪酸鉀(PO)構(gòu)建HUA小鼠模型，以AP為陽(yáng)性藥物，依據(jù)血尿酸(UA)濃度、血清和肝臟黃嘌呤氧化酶(XO)活性、血肌酐(Cr)濃度以及肝臟、腎臟病理學(xué)變化考察其體內(nèi)降尿酸活性，初步分析作用機(jī)制，以期豐富降尿酸活性成分組成，為玉米花絲資源的充分利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

干玉米花絲，品種為遼育606，秋季收集自大連仟和市場(chǎng)。清潔級(jí)雄性昆明種小鼠(ID SCXK2020-0001)，體重(20±2) g，8周齡，遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司；氧嗪酸鉀，麥克林有限責(zé)任公司；別嘌呤醇，阿拉丁試劑(上海)有限公司；血尿酸、黃嘌呤氧化酶、血肌酐試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒，北京索萊科技有限寶公司；DEAE-52纖維素，BXD公司。

CXG-1F層析柜，上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；CR22N高速冷凍離心機(jī)，日立工機(jī)株式會(huì)社；10ND冷凍真空干燥機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；Infinite M200多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.2 方 法

1.2.1 玉米花絲中性多糖的制備

1.2.1.1 粗多糖的提取

按照Chen等[10]的方法提取粗多糖。精確稱(chēng)取1 g干玉米花絲，利用熱水浸提法在料液比1∶100、80 ℃提取90 min。8 000 r/min離心水提液20 min，保留上層溶液，蒸發(fā)濃縮，添加乙醇溶液，終體積分?jǐn)?shù)為70%，4 ℃下靜止24 h。加入蒸餾水以重新溶解沉淀，凍干后獲得水提玉米花絲粗多糖(CCSP)。

1.2.1.2 脫色脫蛋白及透析處理

CCSP經(jīng)過(guò)氧化氫脫色，以體積比1∶0.2添加Sevag溶液(氯仿與正丁醇體積比5∶1)，以去除其中的蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，重復(fù)6次，合并所得液體，濃縮去除有機(jī)試劑[11]。經(jīng)流動(dòng)水和蒸餾水分別透析處理2 d，凍干樣品。

1.2.1.3 DEAE-52柱層析

將預(yù)先吸水充分溶脹、NaOH/HCl/NaOH溶液分別浸潤(rùn)30 min，用蒸餾水不斷沖洗直至中性的DEAE-52纖維素填入規(guī)格為Φ3.0 cm×60 cm 的純化柱中。將脫色脫蛋白并透析處理的CCSP樣品重新溶解后裝入該純化柱中，以1 mL/min 的體積流量連續(xù)通入蒸餾水，直至無(wú)多糖組分被洗脫。該中性多糖組分命名為NCSP，苯酚-濃硫酸法測(cè)定其中的多糖類(lèi)物質(zhì)[12]。

1.2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)

雄性昆明種小鼠在溫度(22±2) ℃、相對(duì)濕度(50±15)%、正常暗/光循環(huán)(12 h/12 h)條件下適應(yīng)至少一周，其間自由進(jìn)食及飲水。

1.2.3 高尿酸血癥模型小鼠的構(gòu)建

根據(jù)Zhang等[13]的方法并稍做修改后建立HUA小鼠模型，造模藥為PO，陽(yáng)性藥為AP。將小鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，NCSP低、中、高劑量組(10、20、40 mg/kg)。正常對(duì)照組在7 d內(nèi)均接受生理鹽水處理，其余各組用250 mg/kg的PO處理以誘導(dǎo)HUA。1 h后，正常和模型對(duì)照組用生理鹽水處理，陽(yáng)性對(duì)照組、NCSP 3個(gè)給藥組各自給予5 mg/kg的AP和相應(yīng)濃度的NCSP。處理6 d后，在最終給藥處理前12 h將食物撤出。灌胃1 h后，于眼球處采血，檢測(cè)血液相關(guān)指標(biāo)。頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，當(dāng)即分離肝、腎、脾、心并稱(chēng)重。其中一部分腎、肝臟樣本處理后進(jìn)行病理學(xué)研究。另取部分肝臟組織用以評(píng)價(jià)肝臟XO活性。

1.2.4 高尿酸血癥小鼠生化指標(biāo)的測(cè)定

依照相應(yīng)試劑盒的指示說(shuō)明，評(píng)價(jià)血UA、Cr水平及血清和肝臟XO活性。

1.2.4.1 血清UA的測(cè)定

將5 μL蒸餾水或UA標(biāo)準(zhǔn)溶液(400 μmol/L)或小鼠血清樣品與250 μL試劑1混合均勻，37 ℃下保持靜止10 min而后檢測(cè)各樣品在510 nm的吸光度。血清尿酸濃度按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：Ac為小鼠血清樣品的吸光度；As為UA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度；A0為空白對(duì)照(蒸餾水)的吸光度；cs為UA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μmol/L。

1.2.4.2 血清和肝臟XO活性的測(cè)定

向100 μL勻漿樣品中依次加入1.0 mL試劑1、0.05 mL試劑2、0.2 mL試劑3和0.02 mL試劑4，37 ℃水浴20 min。加入1 mL試劑5搖勻后檢測(cè)各反應(yīng)液在530 nm的吸光度。血清X(qián)O酶活單位的定義：每毫升血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol尿酸為一個(gè)酶活力單位(U/L)。肝臟XO酶活單位的定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol尿酸為一個(gè)酶活力單位(U/g)。

(2)

式中：A′c為小鼠血清樣品的吸光度；A′0為空白對(duì)照(蒸餾水)的吸光度；V為反應(yīng)溶液總體積，L；Vc為樣品體積，L；t為反應(yīng)時(shí)間，20 min；12.6×10-3為尿酸摩爾吸光系數(shù)與孔板光徑的乘積，mL/nmol。

(3)

式中：A″c為小鼠肝勻漿上清樣品的吸光度；A0為空白對(duì)照(蒸餾水)的吸光度；V″為反應(yīng)溶液總體積，L；V″c為樣品體積，L；t為反應(yīng)時(shí)間，20 min；12.6×10-3為尿酸摩爾吸光系數(shù)與孔板光徑的乘積，mL/nmol；cc為肝勻漿上清的蛋白濃度，由BCA試劑盒測(cè)定。

1.2.4.3 血清Cr的測(cè)定

將6 μL蒸餾水、Cr標(biāo)準(zhǔn)溶液(442 μmol/L)、小鼠血清樣品分別與180 μL試劑1混合均勻，37 ℃下溫 育5 min，在546 nm處測(cè)定吸光度(A1)。繼續(xù)添加180 μL試劑2，測(cè)定吸光度(A2)。血清Cr濃度按公式(4)計(jì)算。

(4)

式中：Ac1、Ac2為小鼠血清樣品的吸光度，As1、As2為Cr標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，k為稀釋因子，A01、A02為空白對(duì)照(蒸餾水)的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為(均值±SD)。利用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析，確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。利用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米花絲中性多糖對(duì)高尿酸血癥模型小鼠生化指標(biāo)的影響

2.1.1 對(duì)高尿酸血癥小鼠血尿酸濃度的影響

如圖1(a)所示，PO誘導(dǎo)的HUA模型小鼠血清UA濃度與未經(jīng)藥物處理的正常小鼠相比顯著增加，二者間存在明顯差異(P<0.001)，表明HUA小鼠模型成功建立。與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥物AP和NCSP低、中、高劑量組血清UA水平均顯著下降，分別下降66.67%、45.68%、50.51%和57.56%(P<0.001)，表明NCSP擁有抗HUA的能力，且活性呈劑量依賴(lài)。尿酸鹽是血漿中主要的抗氧化劑之一，其極低水平長(zhǎng)期存在極有可能引發(fā)其他疾病，且其與死亡率之間存在U型曲線(xiàn)關(guān)系[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中各劑量的NCSP均未將血清UA降至極低水平，其值與正常對(duì)照組接近，提示NCSP具有作為功能食品成分降低血清UA水平、治療HUA的應(yīng)用潛力。

2.1.2 對(duì)高尿酸血癥小鼠血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響

XO是產(chǎn)生UA的關(guān)鍵酶，其活性升高會(huì)引起UA水平的升高，抑制該酶活性是阻斷體內(nèi)UA過(guò)量合成，并在臨床上治療痛風(fēng)的有效途徑[16]。為了探究NCSP降尿酸作用機(jī)制，對(duì)XO活性進(jìn)行測(cè)定。如圖2(b)和圖2(c)所示，模型對(duì)照組小鼠血清和肝臟中的XO活性均明顯提高(P<0.01)，分別達(dá)到9.40 U/L和2.90 U/g，說(shuō)明經(jīng)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)后，在嘌呤分解代謝的最后步驟中負(fù)責(zé)將次黃嘌呤分解成黃嘌呤、最終產(chǎn)生UA的XO活性被激活并提高。與圖1(a)所示PO導(dǎo)致HUA小鼠血清UA濃度明顯增加的結(jié)果一致。NCSP組血清和肝臟XO活性均隨劑量增大而表現(xiàn)出更大程度的減弱，說(shuō)明NCSP對(duì)XO活性具有抑制作用。其中血清X(qián)O活性在中、高劑量時(shí)分別降低了14.47%(P<0.05)和19.89%(P<0.01)；肝臟XO活性在中、高劑量時(shí)分別降低了6.90%和7.24%。提示NCSP能夠以降低XO活性阻礙UA產(chǎn)生的方式表現(xiàn)出抗HUA的能力。

(a) 血清尿酸

2.1.3 對(duì)高尿酸血癥小鼠血肌酐濃度的影響

UA被認(rèn)為是慢性腎臟疾病發(fā)展的潛在危險(xiǎn)因素，因此本研究探討NCSP對(duì)小鼠腎臟功能的影響。在實(shí)際應(yīng)用中，血清Cr濃度常用來(lái)體現(xiàn)腎功能狀況[17]。如圖1(d)所示，相較于空白對(duì)照組，模型對(duì)照組小鼠血清Cr水平顯著升高。中劑量和高劑量組能夠更好地降低HUA小鼠的血清Cr水平，分別降低了20.07%(P<0.05)和30.02%(P<0.01)，作用效果比陽(yáng)性藥物更好。提示NCSP具有改善腎損害的能力，可能與腎UA清除率增加有關(guān)[5]。

2.2 玉米花絲中性多糖對(duì)高尿酸血癥模型小鼠病理組織學(xué)的影響

2.2.1 對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟組織的影響

腎臟在HUA發(fā)生中的作用巨大，70%的UA由腎臟排出，其發(fā)生病變會(huì)造成UA直接排泄不足，增加血液UA水平，引起HUA[18-19]。如圖2所示，空白對(duì)照組小鼠腎組織清晰完整，未見(jiàn)病理?yè)p傷。模型對(duì)照組小鼠腎臟組織形態(tài)被破壞，腎小球嚴(yán)重萎縮，腎小管擴(kuò)張，管腔不規(guī)則，說(shuō)明PO引起了嚴(yán)重的腎損傷。NCSP治療后，小鼠腎臟結(jié)構(gòu)均有不同程度的恢復(fù)，其中高劑量組小鼠的腎臟組織恢復(fù)效果更好，該結(jié)果與其對(duì)UA和Cr濃度的影響一致。說(shuō)明NCSP通過(guò)保護(hù)HUA小鼠的腎臟功能，增加腎UA排泄量，減少了模型小鼠血清UA含量。

(a) 空白對(duì)照組

2.2.2 對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟組織的影響

如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，各劑量組小鼠肝組織均不存在變性、腫脹等其他病理學(xué)變化，說(shuō)明NCSP對(duì)小鼠無(wú)毒性作用。

(a) 空白對(duì)照組

2.3 玉米花絲中性多糖對(duì)高尿酸血癥模型小鼠生理指標(biāo)的影響

2.3.1 對(duì)高尿酸血癥小鼠臟器系數(shù)的影響

不同劑量多糖對(duì)高尿酸血癥模型小鼠臟器系數(shù)的影響如表1所示。結(jié)果表明，多糖對(duì)小鼠的肝、腎、心和脾臟系數(shù)的影響不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說(shuō)明玉米花絲多糖并未引起小鼠臟器質(zhì)量明顯變化，安全可靠。

表1 不同劑量NCSP對(duì)高尿酸血癥模型小鼠臟器系數(shù)的影響

2.3.2 對(duì)高尿酸血癥小鼠體重的影響

不同劑量多糖對(duì)高尿酸血癥模型小鼠體重的影響如表2所示。結(jié)果表明，小鼠體重與對(duì)照組相比差別不大(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)期間小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象，證明3種劑量的玉米花絲多糖對(duì)小鼠健康沒(méi)有顯著影響。

表2 不同劑量NCSP對(duì)高尿酸血癥模型小鼠體重的影響

3 結(jié) 論

通過(guò)DEAE-52纖維素柱層析法實(shí)現(xiàn)了玉米花絲多糖類(lèi)化合物的分離純化，研究了其對(duì)PO所致HUA模型小鼠的影響。結(jié)果表明，純化的NCSP顯著降低HUA模型小鼠體內(nèi)UA濃度。同時(shí)，血清Cr水平顯著降低。腎臟組織病理學(xué)分析證明NCSP具有較好的減輕腎臟損害的能力。對(duì)血清和肝臟中XO活性進(jìn)行測(cè)定，得到NCSP降尿酸作用機(jī)制之一是通過(guò)抑制該酶活性減少UA產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出抗HUA的作用。玉米花絲中性多糖的抗高尿酸血癥作用與其抑制黃嘌呤氧化酶活性、減少血尿酸生成、保護(hù)腎功能損害促進(jìn)血尿酸排泄有關(guān)。