基于氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠模型評價玉米花絲中性多糖的降尿酸作用

苑 麗 艷， 姜 鵬 飛，2， 祁 立 波，2， 傅 寶 尚，2， 林 松 毅，2

(1.大連工業(yè)大學 食品學院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

高尿酸血癥(HUA)的發(fā)生受血尿酸(UA)水平的調(diào)控，當機體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，腎臟UA排泄不足引起體內(nèi)UA濃度異常增加，高于416 μmol/L 時，即為高尿酸血癥[1]，會導致痛風、炎癥反應及其他代謝性疾病，心血管疾病、急慢性腎病等的患病概率增加[2-3]。由于生活水平的提高以及人們飲食習慣的變化等，全球越來越多的人患上HUA，且患者呈現(xiàn)明顯的低齡化趨勢[4]。目前診治HUA和痛風的有效藥物如別嘌呤醇(AP)等均可能導致患者出現(xiàn)嚴重的惡性反應，甚至死亡[5]。因此尋找具有抗HUA作用且更加安全的活性物質(zhì)意義重大。

玉米花絲資源豐富、來源廣闊，含有多種有益的生物活性成分，在民間常被煮水后飲用治療腎炎、高血壓、糖尿病等疾病，或與其他藥物配伍使用治療痛風[6]。多糖是其最主要的活性成分[7]。研究表明，玉米花絲多糖在利尿、抗糖尿病、降血脂等方面均表現(xiàn)出良好的藥理作用，是一種潛在的功能制劑[8-9]。然而，關(guān)于玉米花絲多糖對HUA的作用尚未有明確的報道。

本實驗以玉米花絲為原料，從中分離純化得到一種中性多糖，利用氧嗪酸鉀(PO)構(gòu)建HUA小鼠模型，以AP為陽性藥物，依據(jù)血尿酸(UA)濃度、血清和肝臟黃嘌呤氧化酶(XO)活性、血肌酐(Cr)濃度以及肝臟、腎臟病理學變化考察其體內(nèi)降尿酸活性，初步分析作用機制，以期豐富降尿酸活性成分組成，為玉米花絲資源的充分利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

干玉米花絲，品種為遼育606，秋季收集自大連仟和市場。清潔級雄性昆明種小鼠(ID SCXK2020-0001)，體重(20±2) g，8周齡，遼寧長生生物科技有限公司；氧嗪酸鉀，麥克林有限責任公司；別嘌呤醇，阿拉丁試劑(上海)有限公司；血尿酸、黃嘌呤氧化酶、血肌酐試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒，北京索萊科技有限寶公司；DEAE-52纖維素，BXD公司。

CXG-1F層析柜，上海青浦滬西儀器廠；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；CR22N高速冷凍離心機，日立工機株式會社；10ND冷凍真空干燥機，寧波新芝生物科技有限公司；Infinite M200多功能酶標儀，瑞士TECAN公司。

1.2 方 法

1.2.1 玉米花絲中性多糖的制備

1.2.1.1 粗多糖的提取

按照Chen等[10]的方法提取粗多糖。精確稱取1 g干玉米花絲，利用熱水浸提法在料液比1∶100、80 ℃提取90 min。8 000 r/min離心水提液20 min，保留上層溶液，蒸發(fā)濃縮，添加乙醇溶液，終體積分數(shù)為70%，4 ℃下靜止24 h。加入蒸餾水以重新溶解沉淀，凍干后獲得水提玉米花絲粗多糖(CCSP)。

1.2.1.2 脫色脫蛋白及透析處理

CCSP經(jīng)過氧化氫脫色，以體積比1∶0.2添加Sevag溶液(氯仿與正丁醇體積比5∶1)，以去除其中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，重復6次，合并所得液體，濃縮去除有機試劑[11]。經(jīng)流動水和蒸餾水分別透析處理2 d，凍干樣品。

1.2.1.3 DEAE-52柱層析

將預先吸水充分溶脹、NaOH/HCl/NaOH溶液分別浸潤30 min，用蒸餾水不斷沖洗直至中性的DEAE-52纖維素填入規(guī)格為Φ3.0 cm×60 cm 的純化柱中。將脫色脫蛋白并透析處理的CCSP樣品重新溶解后裝入該純化柱中，以1 mL/min 的體積流量連續(xù)通入蒸餾水，直至無多糖組分被洗脫。該中性多糖組分命名為NCSP，苯酚-濃硫酸法測定其中的多糖類物質(zhì)[12]。

1.2.2 動物飼養(yǎng)

雄性昆明種小鼠在溫度(22±2) ℃、相對濕度(50±15)%、正常暗/光循環(huán)(12 h/12 h)條件下適應至少一周，其間自由進食及飲水。

1.2.3 高尿酸血癥模型小鼠的構(gòu)建

根據(jù)Zhang等[13]的方法并稍做修改后建立HUA小鼠模型，造模藥為PO，陽性藥為AP。將小鼠隨機分為6組：空白對照組，模型對照組，陽性對照組，NCSP低、中、高劑量組(10、20、40 mg/kg)。正常對照組在7 d內(nèi)均接受生理鹽水處理，其余各組用250 mg/kg的PO處理以誘導HUA。1 h后，正常和模型對照組用生理鹽水處理，陽性對照組、NCSP 3個給藥組各自給予5 mg/kg的AP和相應濃度的NCSP。處理6 d后，在最終給藥處理前12 h將食物撤出。灌胃1 h后，于眼球處采血，檢測血液相關(guān)指標。頸椎脫臼法處死實驗動物，當即分離肝、腎、脾、心并稱重。其中一部分腎、肝臟樣本處理后進行病理學研究。另取部分肝臟組織用以評價肝臟XO活性。

1.2.4 高尿酸血癥小鼠生化指標的測定

依照相應試劑盒的指示說明，評價血UA、Cr水平及血清和肝臟XO活性。

1.2.4.1 血清UA的測定

將5 μL蒸餾水或UA標準溶液(400 μmol/L)或小鼠血清樣品與250 μL試劑1混合均勻，37 ℃下保持靜止10 min而后檢測各樣品在510 nm的吸光度。血清尿酸濃度按式(1)計算。

(1)

式中：Ac為小鼠血清樣品的吸光度；As為UA標準溶液的吸光度；A0為空白對照(蒸餾水)的吸光度；cs為UA標準溶液濃度，μmol/L。

1.2.4.2 血清和肝臟XO活性的測定

向100 μL勻漿樣品中依次加入1.0 mL試劑1、0.05 mL試劑2、0.2 mL試劑3和0.02 mL試劑4，37 ℃水浴20 min。加入1 mL試劑5搖勻后檢測各反應液在530 nm的吸光度。血清XO酶活單位的定義：每毫升血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol尿酸為一個酶活力單位(U/L)。肝臟XO酶活單位的定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol尿酸為一個酶活力單位(U/g)。

(2)

式中：A′c為小鼠血清樣品的吸光度；A′0為空白對照(蒸餾水)的吸光度；V為反應溶液總體積，L；Vc為樣品體積，L；t為反應時間，20 min；12.6×10-3為尿酸摩爾吸光系數(shù)與孔板光徑的乘積，mL/nmol。

(3)

式中：A″c為小鼠肝勻漿上清樣品的吸光度；A0為空白對照(蒸餾水)的吸光度；V″為反應溶液總體積，L；V″c為樣品體積，L；t為反應時間，20 min；12.6×10-3為尿酸摩爾吸光系數(shù)與孔板光徑的乘積，mL/nmol；cc為肝勻漿上清的蛋白濃度，由BCA試劑盒測定。

1.2.4.3 血清Cr的測定

將6 μL蒸餾水、Cr標準溶液(442 μmol/L)、小鼠血清樣品分別與180 μL試劑1混合均勻，37 ℃下溫 育5 min，在546 nm處測定吸光度(A1)。繼續(xù)添加180 μL試劑2，測定吸光度(A2)。血清Cr濃度按公式(4)計算。

(4)

式中：Ac1、Ac2為小鼠血清樣品的吸光度，As1、As2為Cr標準溶液的吸光度，k為稀釋因子，A01、A02為空白對照(蒸餾水)的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果表示為(均值±SD)。利用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析，確定統(tǒng)計學差異。利用GraphPad Prism 8.3.0軟件進行統(tǒng)計圖繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米花絲中性多糖對高尿酸血癥模型小鼠生化指標的影響

2.1.1 對高尿酸血癥小鼠血尿酸濃度的影響

如圖1(a)所示，PO誘導的HUA模型小鼠血清UA濃度與未經(jīng)藥物處理的正常小鼠相比顯著增加，二者間存在明顯差異(P<0.001)，表明HUA小鼠模型成功建立。與模型對照組相比，陽性藥物AP和NCSP低、中、高劑量組血清UA水平均顯著下降，分別下降66.67%、45.68%、50.51%和57.56%(P<0.001)，表明NCSP擁有抗HUA的能力，且活性呈劑量依賴。尿酸鹽是血漿中主要的抗氧化劑之一，其極低水平長期存在極有可能引發(fā)其他疾病，且其與死亡率之間存在U型曲線關(guān)系[14-15]。本實驗中各劑量的NCSP均未將血清UA降至極低水平，其值與正常對照組接近，提示NCSP具有作為功能食品成分降低血清UA水平、治療HUA的應用潛力。

2.1.2 對高尿酸血癥小鼠血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響

XO是產(chǎn)生UA的關(guān)鍵酶，其活性升高會引起UA水平的升高，抑制該酶活性是阻斷體內(nèi)UA過量合成，并在臨床上治療痛風的有效途徑[16]。為了探究NCSP降尿酸作用機制，對XO活性進行測定。如圖2(b)和圖2(c)所示，模型對照組小鼠血清和肝臟中的XO活性均明顯提高(P<0.01)，分別達到9.40 U/L和2.90 U/g，說明經(jīng)氧嗪酸鉀誘導后，在嘌呤分解代謝的最后步驟中負責將次黃嘌呤分解成黃嘌呤、最終產(chǎn)生UA的XO活性被激活并提高。與圖1(a)所示PO導致HUA小鼠血清UA濃度明顯增加的結(jié)果一致。NCSP組血清和肝臟XO活性均隨劑量增大而表現(xiàn)出更大程度的減弱，說明NCSP對XO活性具有抑制作用。其中血清XO活性在中、高劑量時分別降低了14.47%(P<0.05)和19.89%(P<0.01)；肝臟XO活性在中、高劑量時分別降低了6.90%和7.24%。提示NCSP能夠以降低XO活性阻礙UA產(chǎn)生的方式表現(xiàn)出抗HUA的能力。

(a) 血清尿酸

2.1.3 對高尿酸血癥小鼠血肌酐濃度的影響

UA被認為是慢性腎臟疾病發(fā)展的潛在危險因素，因此本研究探討NCSP對小鼠腎臟功能的影響。在實際應用中，血清Cr濃度常用來體現(xiàn)腎功能狀況[17]。如圖1(d)所示，相較于空白對照組，模型對照組小鼠血清Cr水平顯著升高。中劑量和高劑量組能夠更好地降低HUA小鼠的血清Cr水平，分別降低了20.07%(P<0.05)和30.02%(P<0.01)，作用效果比陽性藥物更好。提示NCSP具有改善腎損害的能力，可能與腎UA清除率增加有關(guān)[5]。

2.2 玉米花絲中性多糖對高尿酸血癥模型小鼠病理組織學的影響

2.2.1 對高尿酸血癥小鼠腎臟組織的影響

腎臟在HUA發(fā)生中的作用巨大，70%的UA由腎臟排出，其發(fā)生病變會造成UA直接排泄不足，增加血液UA水平，引起HUA[18-19]。如圖2所示，空白對照組小鼠腎組織清晰完整，未見病理損傷。模型對照組小鼠腎臟組織形態(tài)被破壞，腎小球嚴重萎縮，腎小管擴張，管腔不規(guī)則，說明PO引起了嚴重的腎損傷。NCSP治療后，小鼠腎臟結(jié)構(gòu)均有不同程度的恢復，其中高劑量組小鼠的腎臟組織恢復效果更好，該結(jié)果與其對UA和Cr濃度的影響一致。說明NCSP通過保護HUA小鼠的腎臟功能，增加腎UA排泄量，減少了模型小鼠血清UA含量。

(a) 空白對照組

2.2.2 對高尿酸血癥小鼠肝臟組織的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，各劑量組小鼠肝組織均不存在變性、腫脹等其他病理學變化，說明NCSP對小鼠無毒性作用。

(a) 空白對照組

2.3 玉米花絲中性多糖對高尿酸血癥模型小鼠生理指標的影響

2.3.1 對高尿酸血癥小鼠臟器系數(shù)的影響

不同劑量多糖對高尿酸血癥模型小鼠臟器系數(shù)的影響如表1所示。結(jié)果表明，多糖對小鼠的肝、腎、心和脾臟系數(shù)的影響不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)。說明玉米花絲多糖并未引起小鼠臟器質(zhì)量明顯變化，安全可靠。

表1 不同劑量NCSP對高尿酸血癥模型小鼠臟器系數(shù)的影響

2.3.2 對高尿酸血癥小鼠體重的影響

不同劑量多糖對高尿酸血癥模型小鼠體重的影響如表2所示。結(jié)果表明，小鼠體重與對照組相比差別不大(P>0.05)。實驗期間小鼠無死亡現(xiàn)象，證明3種劑量的玉米花絲多糖對小鼠健康沒有顯著影響。

表2 不同劑量NCSP對高尿酸血癥模型小鼠體重的影響

3 結(jié) 論

通過DEAE-52纖維素柱層析法實現(xiàn)了玉米花絲多糖類化合物的分離純化，研究了其對PO所致HUA模型小鼠的影響。結(jié)果表明，純化的NCSP顯著降低HUA模型小鼠體內(nèi)UA濃度。同時，血清Cr水平顯著降低。腎臟組織病理學分析證明NCSP具有較好的減輕腎臟損害的能力。對血清和肝臟中XO活性進行測定，得到NCSP降尿酸作用機制之一是通過抑制該酶活性減少UA產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出抗HUA的作用。玉米花絲中性多糖的抗高尿酸血癥作用與其抑制黃嘌呤氧化酶活性、減少血尿酸生成、保護腎功能損害促進血尿酸排泄有關(guān)。