固定化脂肪酶制備條件優(yōu)化及催化應用

田 家 英， 張 江 華， 崔 勵， 王 大 鷙

( 大連工業(yè)大學 輕工與化學工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一類能夠催化水解、酯化等多種反應的高效生物催化劑，被廣泛應用于食品加工[1]、乳制品[2]、飼料工業(yè)[3]、生物能源[4]、生物醫(yī)藥[5]、洗滌[6]、紡織[7]等領域。脂肪酶在催化反應的過程中，具有較高的立體特異性和區(qū)域特異性及催化條件溫和、環(huán)境友好、能耗低、副產物少等優(yōu)點。然而，游離脂肪酶在催化過程中普遍存在穩(wěn)定性、分離性、重復利用性差等缺點[8]，阻礙對其進一步的開發(fā)和應用。固定化脂肪酶被認為是克服游離脂肪酶上述缺點的有效方法之一。目前，常用的固定化酶技術主要有吸附法、共價結合法、交聯法和包埋法，其中交聯法得到廣泛應用，主要因為其操作簡便，同時又能使酶與載體結合牢固，進而提高固定化酶的重復利用性[9]。固定化酶的另一個技術要點為對固定化載體的選擇，而高分子聚合物因其優(yōu)異的穩(wěn)定性和可控制的孔結構在固定化酶領域的應用受到廣泛關注。近年來，聚芳醚砜(PAES)因其良好的耐高溫、耐水解和尺寸穩(wěn)定性而被廣泛用作工程塑料[10-12]。PAES的剛性結構，使其熱變形溫度相對較高，因而可在高溫下長期使用[13]；此外，PAES表面形態(tài)和結構的特殊性，使其具有較大的比表面積、更快的吸附速度和良好的生物相容性[13]；再者，PAES具有對強酸和強堿的耐受性高、可回收性好等優(yōu)點，進一步表明其具有作為固定化酶優(yōu)良載體的應用潛力[14-15]。本文以實驗室自制含羧基側鏈的PAES多孔聚合物為載體，采用交聯法進行固定化脂肪酶的制備，通過單因素及響應面試驗探究固定化脂肪酶的最佳制備條件，并對該固定化脂肪酶進行催化酯化反應的應用了初探。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PAES-C，實驗室制備；米曲霉脂肪酶，阿拉丁化學試劑公司；FA25高剪切均質乳化機，THZ-82A恒溫水浴搖床。

1.2 方 法

1.2.1 固定化脂肪酶的制備

將戊二醛溶解在0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中，得到1.0%的戊二醛溶液。用戊二醛溶液活化PAES-C，同時在體系中加入等質量的脂肪酶。將混合物置于恒溫水浴搖床(200 r/min)中，并在30 ℃下孵育5 h。孵育結束后用磷酸鹽緩沖液洗滌2～3次，去除載體表面的戊二醛及未固定的游離酶，室溫干燥后即得到固定化脂肪酶。

1.2.2 單因素優(yōu)化試驗

固定搖床轉速為200 r/min，依次改變戊二醛質量分數、戊二醛添加量、pH、固定化時間、固定化溫度等因素，研究不同變量對固定化脂肪酶酶活的影響規(guī)律。各因素水平梯度：戊二醛質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，戊二醛添加量為1、2、3、4、5 mL，pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，固定化時間為3、4、5、6、7 h，固定化溫度為20、30、40、50、60 ℃。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗

根據單因素對固定化脂肪酶的影響實驗結果，選取戊二醛質量分數(A)、pH(B)、固定化溫度(C)3個影響較為顯著的單因素，并以酶活力為響應面值，根據Box-Behnken設計原理設計響應面試驗，從而得到固定化酶的最佳制備條件。試驗因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素水平

1.2.4 脂肪酶酶活力的測定方法

參照GB/T 23535—2009的標準方法測定脂肪酶的水解活力。

底物溶液的制備：將橄欖油和4%聚乙烯醇溶液以體積比1∶3的比例混合，分兩次使用高剪切均質乳化機進行乳化處理，每次持續(xù)3 min，且中間間隔5 min。將所得底物溶液置于冰箱中4 ℃ 儲存，每次使用前需進行乳化處理。

脂肪酶水解活力的測定：向錐形瓶中加4 mL底物溶液和5 mL磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH=7.5)。將該混合液置于37 ℃水浴中保溫5 min，向其中加入固定化酶或一定量游離酶，并在37 ℃、100 r/min反應15 min，加入15 mL的95%乙醇終止反應。向混合液中滴入3～4滴酚酞指示劑，采用氫氧化鈉溶液(0.05 mol/L)進行脂肪酸釋放量的滴定。同時進行空白對照實驗。所有反應均采取三平行操作，并取其平均值。酶活力單位(U)是指在37 ℃、pH=7.5、100 r/min條件下每分鐘產生1 μmol游離脂肪酸(μmol/min)的游離酶量或固定化酶量[16]。

酶活計算公式[17]：

X=(V-V0)×c×10/tm

式中：V為滴定樣品所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；V0為滴定空白所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；t為酶反應的時間，15 min；m為加入酶(固定化酶或游離酶)的質量，g。

1.2.5 固定化脂肪酶的催化應用

所制備固定化脂肪酶具備低耗能、環(huán)保等優(yōu)勢，進一步對其進行生物基衍生物2，5-四氫呋喃二甲醇(THFDM)與脂肪酸間催化酯化反應研究具有重要意義。THFDM由5-羥甲基糠醛加氫還原產生，屬于綠色持續(xù)可再生資源，由于該固定化脂肪酶具有低溫下高活性的應用特點，選用壬酸與THFDM在35 ℃低溫下、搖床(200 r/min)中反應48 h。反應結束后，首先將固定化脂肪酶進行抽濾分離，并先后用去離子水和碳酸鈉溶液洗滌濾液以除去未反應的反應物；隨后采用乙酸乙酯萃取該濾液，分離有機相、旋蒸去除溶劑，所得樣品即為羧酸酯粗產物。對該粗產物進一步進行紅外、核磁表征，分析其化學結構。

2 結果與討論

2.1 戊二醛質量分數對固定化脂肪酶酶活的影響

如圖1所示，隨著戊二醛質量分數的增加，固定化脂肪酶酶活有先增加后減小的趨勢，且以1.5%戊二醛為交聯劑時相對活性最高。戊二醛質量分數小于1.5%時，聚合物載體表面活化不足而易導致酶活低；戊二醛質量分數高于1.5%時，戊二醛的過度自交聯可能對脂肪酶的固定化產生空間位阻效應，最終導致固定化效率下降。因此，戊二醛對PAES-C表面活化的最佳質量分數為1.5%。

圖1 戊二醛質量分數對固定化脂肪酶酶活的影響

2.2 戊二醛添加量對固定化脂肪酶酶活的影響

從圖2可知，當戊二醛添加量為1～3 mL時，固定化脂肪酶的酶活呈現逐步上升趨勢，且當添加量增至3 mL時，酶活達到峰值；當戊二醛添加量大于3 mL時，酶活持續(xù)下降。這可能由于在酶的添加量一定的情況下，當戊二醛增加到一定量時，脂肪酶剛好與戊二醛完全發(fā)生交聯反應；戊二醛添加量繼續(xù)增加時，交聯反應過剩的戊二醛則容易發(fā)生自交聯進而產生空間位阻效應，最終導致酶活出現下降趨勢。因此，戊二醛添加量為3 mL時，脂肪酶的固定化效果最好。

圖2 戊二醛添加量對固定化脂肪酶酶活的影響

2.3 pH對固定化脂肪酶酶活的影響

如圖3所示，在pH 5.0～9.0，隨著pH的升高，脂肪酶活性先呈現升高趨勢，且當pH升高到8.0時酶活達到峰值；當pH大于8.0時，脂肪酶活性呈下降趨勢。這可能是因為戊二醛在強堿性環(huán)境中更容易與蛋白質分子結合形成環(huán)狀吡啶的剛性結構，從而抑制酶與底物的結合，最終導致脂肪酶的活性降低。因此，固定化脂肪酶的最佳pH環(huán)境為8.0。

圖3 pH對固定化脂肪酶酶活的影響

2.4 固定化時間對固定化脂肪酶酶活的影響

如圖4所示，固定化3～6 h固定化脂肪酶的活性呈現先穩(wěn)步上升后下降的趨勢，當固定化時間增加到6 h時，酶活性達到峰值。這可能由于隨著固定化時間的不斷增加，脂肪酶分子持續(xù)進入PAES-C孔洞結構而被負載，當時間增加到一定程度，PAES-C與酶之間的負載位點達到飽和，過量的脂肪酶則會發(fā)生聚集，最終導致脂肪酶暴露在表面的活性位點數量下降[18]。因此，當固定化時間為6 h時，脂肪酶的固定化效果最佳。

圖4 固定化時間對固定化脂肪酶酶活的影響

2.5 固定化溫度對固定化脂肪酶酶活的影響

如圖5所示，在20 ℃時脂肪酶活性較低，這可能因為低溫條件下，席夫堿反應的反應速率較低，而載體表面的固定化脂肪酶尚未達到飽和；隨著溫度的升高，反應速率提高，游離脂肪酶與載體結合更好。不斷升高的溫度會使脂肪酶失活，導致50 ℃以后脂肪酶活性急劇下降。因此，固定化脂肪酶的最佳制備溫度為40 ℃。

圖5 固定化溫度對固定化脂肪酶酶活的影響

2.6 響應面法優(yōu)化固定化脂肪酶的制備條件

2.6.1 二次回歸模型擬合及方差分析

響應面試驗結果采用Design Expert 8.0.6進行回歸擬合。由表2可知，回歸模型具有高度的顯著性，P<0.000 1表明該模型極度顯著，預測值與實際值比較相符，可以用來預測響應值。失擬項為0.301 3(大于0.05)不顯著，說明回歸方程擬合程度良好。離散系數(CV)為7.35%，說明模型方程可以較好地反映真實值。

表2 回歸方程系數顯著性檢驗表

由方差分析結果可知，固定化溫度對酶活的影響最大(小于0.000 1)，其次是pH(0.002 0<0.01)，二者都達到了極度顯著水平。戊二醛質量分數對酶活的影響較小，表現為差異顯著(0.039 0<0.05)。交互項中AC、BC差異顯著，表明戊二醛質量分數與固定化溫度、pH與固定化溫度的交互作用對酶活影響較大，在圖6響應面圖中也可明顯看出。

(a) pH與戊二醛質量分數

2.6.2 最佳反應條件的預測及驗證

通過回歸模型的預測得到PAES-C固定化脂肪酶的最佳制備條件：戊二醛質量分數為1.5%，pH為7.46，固定化溫度為40.89 ℃。此條件下，所制備固定化脂肪酶酶活的理論值最大，為1 267.22 U/g。結合生產實際，各因素水平調整為戊二醛質量分數為1.5%，pH為7.5，固定化溫度為40 ℃，在此條件下通過3次平行實驗進行驗證，測得固定化脂肪酶酶活為1 424.73 U/g。結果與模型預測的理論值相近，說明該模型具有有效性。

2.7 固定化脂肪酶的催化應用初探

圖7 酯化反應粗產物的紅外表征

圖8 酯化反應粗產物的碳核磁表征

3 結 論

以實驗室自制帶羧基側鏈的PAES-C為載體進行固定化脂肪酶的制備，在單因素試驗的基礎上選取戊二醛質量分數、pH、固定化溫度為獨立自變量，固定化脂肪酶酶活為響應值，通過響應面法得到固定化脂肪酶的最佳制備條件：戊二醛質量分數為1.5%，pH為7.46，固定化溫度為40.89 ℃。驗證實驗所得固定化脂肪酶酶活對應為1 424.73 U/g，表明該模型可以較好地預測固定化脂肪酶酶活。該固定化脂肪酶可在低溫35 ℃ 下催化四氫呋喃二甲醇與壬酸反應獲得具有雙酯結構的酯化反應產物。本研究為聚合物載體固定化酶的研究提供了一定理論基礎，并拓寬了聚合物在生物領域的應用范圍。