鼻息肉組織相關(guān)受體表達(dá)與Eos浸潤(rùn)相關(guān)性

趙 冉 許建華

鼻腔組織高度水腫是鼻息肉的主要表現(xiàn)，發(fā)病率為1%～4%[1]。鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，Eos)浸潤(rùn)增多是鼻息肉發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)之一，可致鼻息肉組織微環(huán)境失調(diào)，加重鼻息肉病情[2]。白介素-5(interleukin-5，IL-5)可通過刺激Eos前體細(xì)胞的增殖、分化來(lái)調(diào)節(jié)Eos浸潤(rùn)程度，是Eos的重要趨化因子[3]。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)可與配體相結(jié)合參與多種免疫反應(yīng)過程并調(diào)節(jié)機(jī)體功能，與哮喘、特異性皮炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病的發(fā)病密切相關(guān)[4]。維甲酸相關(guān)孤兒受體(retinoic acid-related orphan γt，RORγt)是小鼠及人類輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)主要轉(zhuǎn)錄因子，通過促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和特異性表達(dá)分泌參與癌癥、感染性疾病和免疫疾病的發(fā)病過程[5]。既往研究[6]指出，IL-5可刺激Eos生物學(xué)活性繼而影響鼻息肉發(fā)病。但AhR、RORγt等細(xì)胞因子是否同樣與Eos浸潤(rùn)以及鼻息肉發(fā)病機(jī)制有關(guān)目前尚不明確。本研究對(duì)鼻息肉患者息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析其與Eos浸潤(rùn)程度之間的關(guān)系，以深入了解鼻息肉的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療鼻息肉提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年3～12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬渝北醫(yī)院耳鼻喉科收治的37例鼻內(nèi)鏡下行鼻竇手術(shù)切除的鼻息肉患者作為息肉組，同期20例行單純鼻中隔偏曲矯正術(shù)的中鼻甲黏膜患者作為正常組。兩組患者性別、年齡、病程等一般資料相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。按照浸潤(rùn)程度不同將患者分為I度浸潤(rùn)組(n=11)、Ⅱ組浸潤(rùn)組(n=17)和Ⅲ度浸潤(rùn)組(n=9)，Ⅰ度浸潤(rùn)組男性7例，女性9例，年齡(32.10±2.85)歲；Ⅱ度浸潤(rùn)組男性9例，女性8例，年齡(32.18±3.11)歲；Ⅲ度浸潤(rùn)組男性5例，女性4例，年齡(32.15±2.79)歲，3組患者性別、年齡等一般資料相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬渝北醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：ZCYLC20200815)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①息肉組患者均符合《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[7]中指出的鼻息肉相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②所有患者均經(jīng)術(shù)前鼻內(nèi)窺鏡檢查、CT檢查及術(shù)后病理檢查證實(shí)為鼻竇炎鼻息肉或鼻中隔偏曲者；③臨床資料完整，均留取鼻息肉或鼻黏膜組織待測(cè)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月內(nèi)接受過糖皮質(zhì)激素、類固醇激素及抗組胺藥物治療者；②近1周內(nèi)并發(fā)急性呼吸道感染者；③合并變異性鼻炎、真菌性鼻竇炎；④合并哮喘患者。

1.3 樣本收集及保存 息肉組患者均于鼻內(nèi)窺鏡視野下鉗取3 mm×3 mm的息肉頭端組織，正常組研究對(duì)象取距鼻甲頭端上緣4～5 mm處的正常黏膜組織，生理鹽水洗去雜質(zhì)后用潔凈的紗布蘸干水分，以4%多聚甲醛固定24～48 h，取其中一部分以石蠟包埋后制成組織切片，另一部分于4℃條件下保存于70%乙醇溶液中。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative Real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)[8]取經(jīng)上述方法處理后的兩組研究對(duì)象冷凍鼻息肉組織及鼻黏膜組織，以Trizol試劑提取組織中的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰荆浱?hào)：KL-170403-10)將樣本中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Invitrogen公司，型號(hào)：ABI 7500)進(jìn)行qRT-PCR，以β-actin(上海艾博抗公司，貨號(hào)：ab8226)為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參檢測(cè)鼻息肉及鼻黏膜組織中IL-5和AhR的表達(dá)水平。見表1。

表1 IL-5和AhR引物設(shè)計(jì)

1.4.2 蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)和免疫組織化學(xué)法 取經(jīng)上述方法處理后的兩組研究對(duì)象鼻息肉及鼻黏膜組織石蠟切片，均行HE染色和RORγt免疫組化[9]。石蠟標(biāo)本脫蠟水化后以pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，以枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù)抗原，室溫下與3%過氧化氫溶液共同孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，與50 μL的RORγt一抗室溫下共同培養(yǎng)1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加50 μL的聚合物增強(qiáng)劑，室溫下共同培養(yǎng)20 min后磷酸鹽緩沖液再次沖洗3次，與50 μL酶標(biāo)鼠抗兔聚合物室溫下共同培養(yǎng)30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次。加入DAB顯色液共同培養(yǎng)5 min，電鏡下觀察到棕黃色或黃色即為陽(yáng)性顯色。蘇木精染色液復(fù)染后以0.1%氯化氫溶液分化，流水沖洗后氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水后透明封片，晾干后電鏡下觀察。

1.5 觀察指標(biāo) ①病情程度：參考《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[7]和文獻(xiàn)[10]對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行視覺模擬量表(visual analog scale，VAS)評(píng)分、CT評(píng)分和內(nèi)鏡評(píng)分；②實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：觀察并比較兩組研究對(duì)象鼻息肉組織和鼻黏膜組織中IL-5、AhR、RORγt和Eos計(jì)數(shù)，依據(jù)400倍鏡視野下100個(gè)炎性細(xì)胞中Eos計(jì)數(shù)水平計(jì)算Eos浸潤(rùn)程度，將浸潤(rùn)指數(shù)為0%～33%視為I度浸潤(rùn)，浸潤(rùn)指數(shù)為34%～66%視為Ⅱ度浸潤(rùn)，浸潤(rùn)指數(shù)為67%～100%視為Ⅲ度浸潤(rùn)[11]。比較不同浸潤(rùn)程度患者鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平，并分析鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平與Eos浸潤(rùn)程度之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象VAS評(píng)分、CT評(píng)分和內(nèi)鏡評(píng)分比較 息肉組患者VAS評(píng)分、CT評(píng)分和內(nèi)鏡評(píng)分均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對(duì)象VAS評(píng)分、CT評(píng)分和內(nèi)鏡評(píng)分比較分)

2.2 兩組研究對(duì)象IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平比較 息肉組患者鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 兩組研究對(duì)象IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平比較

圖1 兩組研究對(duì)象IL-5和AhR的mRNA表達(dá)水平比較

2.3 兩組研究對(duì)象嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度比較 息肉組患者Eos計(jì)數(shù)和Eos密度均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 兩組研究對(duì)象嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度比較

2.4 不同浸潤(rùn)程度患者鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平比較 3組不同浸潤(rùn)程度患者息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

注：A為息肉組；B為正常組；箭頭所示為嗜酸性粒細(xì)胞。

表5 不同浸潤(rùn)程度患者鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平比較

2.5 鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性 鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平與Eos計(jì)數(shù)及Eos密度均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見圖3。

注：IL-5為白介素-5，AhR為芳香烴受體，RORγt為轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體，EOS為嗜酸性粒細(xì)胞。

3 討論

鼻息肉是指鼻腔及鼻竇黏膜并發(fā)慢性炎癥性疾病，患者臨床表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)持續(xù)性鼻塞、流涕且伴有漸進(jìn)性加重，部分患者還因息肉阻塞鼻道、咽鼓管等部位引發(fā)嗅覺減退、耳鳴和聽力下降[12]?，F(xiàn)階段臨床治療鼻息肉多采用糖皮質(zhì)激素輔助鼻內(nèi)鏡切除手術(shù)方式，但存在易復(fù)發(fā)問題[13]。本研究從鼻息肉發(fā)病機(jī)制出發(fā)，探討息肉組織與正常黏膜組織中IL-5、AhR、RORγt表達(dá)和Eos浸潤(rùn)差異，分析IL-5、AhR和RORγt與Eos浸潤(rùn)之間的關(guān)系，旨在為臨床治療鼻息肉提供更多思路。

本研究結(jié)果顯示，息肉患者各項(xiàng)評(píng)分、組織標(biāo)本在IL-5、AhR、RORγt表達(dá)和Eos浸潤(rùn)程度均高于正常組，且3組不同浸潤(rùn)程度患者息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明IL-5、AhR和RORγt在鼻息肉患者Eos浸潤(rùn)及發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。IL-5是誘導(dǎo)Eos浸潤(rùn)的主要炎性細(xì)胞因子[14]，AhR可與小分子配體結(jié)合促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生白介素-17等炎性介質(zhì)[15]，RORγt可與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5結(jié)合加速Th17釋放炎性細(xì)胞因子[16]。Eos浸潤(rùn)是導(dǎo)致鼻息肉加重的重要病理基礎(chǔ)，趨化的Eos大量聚集于臨近息肉組織，引起IL-5、白介素-17等炎性細(xì)胞因子大量釋放，加速中性粒細(xì)胞聚集，并持續(xù)作用于上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、基底膜及呼吸道黏膜，使得息肉附近血管通透性增加，EOS浸潤(rùn)和息肉病情進(jìn)行性加重[17]。因此，鼻息肉組織中Eos浸潤(rùn)程度不同，IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平也不同。

本研究發(fā)現(xiàn)，鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達(dá)水平與Eos計(jì)數(shù)及Eos密度均呈正相關(guān)關(guān)系，這與李帥祥等[18]研究結(jié)論相似。IL-5作為誘導(dǎo)Eos浸潤(rùn)發(fā)生的最關(guān)鍵因子，對(duì)于鼻息肉組織中Eos浸潤(rùn)增加具有重要調(diào)節(jié)作用，可與Th17細(xì)胞協(xié)同作用加重Eos浸潤(rùn)[19]。AhR可與其受體結(jié)合參與Th17炎性反應(yīng)的發(fā)生，與低濃度的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和IL-5、白介素-6相互作用，上調(diào)細(xì)胞及組織中RORγt的表達(dá)，誘導(dǎo)TH17細(xì)胞分化，使Th17反應(yīng)增強(qiáng)，誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞分泌大量的白介素-6、前列腺素E2、一氧化氮等炎性介質(zhì)，增厚鼻息肉組織基底膜，加速基質(zhì)纖維化進(jìn)程和組織結(jié)構(gòu)重塑，引起鼻腔黏膜慢性炎癥性損傷[20]，進(jìn)一步增加Eos浸潤(rùn)，引起鼻息肉組織中Eos計(jì)數(shù)和密度增加[21]。

綜上所述，鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt水平與Eos浸潤(rùn)程度有關(guān)，監(jiān)測(cè)上述細(xì)胞因子的表達(dá)可作為預(yù)測(cè)和判斷Eos浸潤(rùn)和鼻息肉發(fā)病的有效指標(biāo)，對(duì)于鼻息肉的臨床診治有較高的指導(dǎo)價(jià)值。