HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究

喬瑞娟 張守亮 張晨光

精神分裂癥是嚴(yán)重的慢性精神性疾病，其主要癥狀為幻覺(jué)、妄想、人格障礙和認(rèn)知功能障礙[1]，給患者、親屬及整個(gè)社會(huì)帶來(lái)很大的痛苦和負(fù)擔(dān)。目前，精神分裂癥的病因仍不明確，遺傳、心理和環(huán)境因素均參與精神分裂癥的發(fā)病，其中遺傳因素解釋70%～90%的表型變異[2]，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與精神分裂癥相關(guān)的易感基因，主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究對(duì)象，它是患精神分裂癥最強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)基因之一[3-4]。人類(lèi)白細(xì)胞抗原G(human leucocyte antigen protein G，HLA-G)位于6p21.31上，是一種非經(jīng)典的MHC I類(lèi)分子，其在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，既往研究[5-6]表明HLA-G的多態(tài)性與病毒感染、子癇前期、炎癥、腫瘤的發(fā)展、移植及自身免疫性疾病相關(guān)，HLA-G的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥，從而增加后代患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)。Rajasekaran等[7]研究表明，攜帶HLA-G 14 bp ins/ins基因型患精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，由此推斷HLA-G基因多態(tài)性很有可能與精神分裂癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。人類(lèi)白細(xì)胞抗原G 3′非翻譯區(qū)(human leucocyte antigen protein G 3′untranslated region，HLA-G 3′UTR)通過(guò)影響mRNA的加工和穩(wěn)定性在HLA-G的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，目前國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少，本研究通過(guò)檢測(cè)健康人群和精神分裂癥患者HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性，探討HLA-G基因多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年10月被新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院確診為精神分裂癥的302例患者作為病例組。精神分裂癥的診斷均符合《國(guó)際疾病和分類(lèi)》 簡(jiǎn)稱(chēng)ICD-10(第10版)精神分裂癥[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重的軀體疾病者；②妊娠期或哺乳期的女性；③合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病者。對(duì)照組由該院同時(shí)期327例健康體檢者組成，排除標(biāo)準(zhǔn)：①有精神性疾病家族史者；②有不良孕產(chǎn)史女性者；③有神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史者。兩組對(duì)象均為漢族，年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：XYLL-20195025)，事先獲得參與本研究的每位患者及其監(jiān)護(hù)人和健康者的知情同意，自愿參與本項(xiàng)研究。

表1 兩組對(duì)象一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取 使用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的外周血基因組提取試劑盒分離出全血DNA，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增 采用PCR擴(kuò)增HLA-G3′UTR，引物序列如下：F：5′-GTTGAGGGGAACAGGGGACAT-3′；R：5′-AAAGTTCTCATGTCTTCCATTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為489 bp。PCR擴(kuò)增體系共25 μL，包括2×PFUMasterMix 12.5 μL、去離子水10.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min變性，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共循環(huán)33次，最后在72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物樣本送北京金維智公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，偏態(tài)分布計(jì)量資料用M(P25，P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。通過(guò)DNAstar V7.0 軟件分析各個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點(diǎn)，使用SHEsis軟件進(jìn)行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg，H-W平衡)、等位基因和基因型頻率、連鎖不平衡及單倍型檢測(cè)。采用logistic回歸分析對(duì)4種遺傳模型(共顯性、顯性、隱性和超顯性)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間HLA-G 3′UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因及基因型分布情況 在HLA-G 3′UTR區(qū)域共檢測(cè)出10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別為14 bp ins/del、+3003 C/T、+3010 G/C、+3027 C/A、+3035 C/T、+3058 G/A、+3072 C/A、+3142 C/G、+3187 A/G、+3196 C/G，僅有14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A這3個(gè)位點(diǎn)符合H-W平衡(P>0.05)。

兩組間等位基因分布相比，+3035 C/T位點(diǎn)等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.522，95%CI：1.146～2.022，P=0.004)，但兩組間14 bp ins/del和+3058 G/A位點(diǎn)等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。對(duì)照組和病例組患者中，14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A位點(diǎn)的基因型分布最高頻率分別為純合del/del、CC和GG，+3035 C/T基因型分布在病例組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)，而14 bp ins/del、+3058 G/A位點(diǎn)基因型分布在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 兩組HLA-G 3’UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因分布情況[例(%)]

表3 兩組HLA-G 3’UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布情況[例(%)]

2.2 +3035 C/T位點(diǎn)不同遺傳模型與精神分裂癥易感性的關(guān)聯(lián) +3035 C/T位點(diǎn)的共顯性模型中，與CC基因型相比，CT基因型(OR=1.450，95%CI：1.019～2.062，P=0.039)和TT基因型(OR=2.275，95%CI：1.064～4.867，P=0.030)與精神分裂癥的易感性相關(guān)。+3035 C/T位點(diǎn)的顯性模型[(CT+TT) 比 CC，OR=1.547，95%CI：1.108～2.161，P=0.010)]與精神分裂癥的易感性相關(guān)。而在+3035 C/T位點(diǎn)的隱性模型中[(CT+CC)比 TT]和超顯性模型中[CT 比 (CC+TT)]，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 +3035 C/T位點(diǎn)不同遺傳模型與精神分裂癥易感性的關(guān)聯(lián)情況[例(%)]

2.3 HLA-G 3’UTR基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡和單倍型分析 14 bp ins/del與+3035 C/T之間D′與R2分別為(0.24，0.20)；14 bp ins/del與+3058 G/A之間D′與R2分別為(0.79，0.20)，+3035 C/T與+3058 G/A之間D′與R2分別為(0.23，0.00)。見(jiàn)圖1。

圖1 HLA-G 3’UTR 3個(gè)SNP連鎖不平衡分析

通過(guò)對(duì)這3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，共得到9個(gè)單倍型，對(duì)于單倍型頻率小于3%的單倍型不予比較分析，剩余4個(gè)單倍型，分別為H1(DCG)、H2(DTG)、H3(ICG)、H4(ITG)，病例組和對(duì)照組主要的單倍型均為H1(DCG)，兩組間單倍型H1及H2頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，單倍型H3(ICG)和單倍型H4(ICG)在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 兩組HLA-G 3’UTR單倍型分布

3 討論

精神分裂癥是一種復(fù)雜的精神疾病，涉及多種遺傳和環(huán)境因素的相互作用，最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究[9-10]數(shù)據(jù)表明，常見(jiàn)的多基因變異與患精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)GABRB3 5′啟動(dòng)子區(qū)rs4906902和rs8179184與精神分裂癥相關(guān)，C-A單倍型可能增加患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn);Azari等[12]發(fā)現(xiàn)GRM7基因rs779867位點(diǎn)的GG基因型與伊朗精神分裂癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該SNP在共顯性和顯性模型中與精神分裂癥發(fā)病相關(guān)。除遺傳變異外，由于暴露于環(huán)境逆境亦可導(dǎo)致精神分裂癥[13-14]，這些研究涉及免疫相關(guān)基因，這些基因在基因與環(huán)境的相互作用中起著至關(guān)重要的作用，MHC已被確定為精神分裂癥的相關(guān)的最強(qiáng)危險(xiǎn)因素之一[3-4]。

位于6 p 21.31上的HLA-G是非經(jīng)典的MHC-I類(lèi)分子，HLA-G作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，通過(guò)其免疫調(diào)節(jié)功能，在各種癌癥、自身免疫性疾病、病毒、寄生蟲(chóng)感染的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。與此同時(shí)，HLA-G被證明與各種精神疾病有關(guān)，例如“低表達(dá)”(HLA-G 14bp Ins/Ins)基因型在冬季出生的雙相障礙患者中較少見(jiàn)，提示14 bp Ins/Ins可能作為雙相障礙的保護(hù)性基因型[15]。此外，14 bp Ins/Ins基因型和14 bp Ins等位基因頻率在自閉癥譜系兒童以及他們的母親中顯著增高[16]。Rajasekaran等[7]發(fā)現(xiàn)14 bp Ins/Ins基因型具有很高的患精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)。HLA-G基因在5′URR(上游調(diào)控區(qū))和3′UTR(非翻譯區(qū))有許多多態(tài)性位點(diǎn)。5′URR的多態(tài)性影響HLA-G基因的轉(zhuǎn)錄，而3′UTR的多態(tài)性影響mRNA的加工和穩(wěn)定性。HLA-G的表達(dá)受3′UTR的多態(tài)性調(diào)控，目前研究較多的多態(tài)性位點(diǎn)為14 bp、+3187 A/G和+3142 C/G，在此區(qū)域還有其他多態(tài)性位點(diǎn)如+3010 G/C、+3072 C/A、+3035 C/T、+3058 G/A等，關(guān)于這些位點(diǎn)與精神分裂癥的研究相對(duì)較少，故本研究旨在研究HLA-G3′UTR基因多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)系，為精神分裂癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在HLA-G 3′UTR這個(gè)區(qū)域共檢測(cè)出10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，僅14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A這3個(gè)位點(diǎn)符合H-W平衡。通過(guò)對(duì)兩組間等位基因和基因型分布進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，14 bp ins/del位點(diǎn)基因多態(tài)性與精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，與Rajasekaran 等[7]的研究不一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于研究的人群和種族不同，導(dǎo)致基因多態(tài)性位點(diǎn)分布不同。本研究發(fā)現(xiàn)，+3058 G/A位點(diǎn)基因多態(tài)性與精神分類(lèi)癥的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，而+3035 C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性與精神分類(lèi)癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，攜帶T等位基因的個(gè)體發(fā)生精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)約是攜帶C等位基因的1.522倍。通過(guò)+3035 C/T位點(diǎn)各個(gè)遺傳模型研究發(fā)現(xiàn)，+3035 C/T位點(diǎn)的共顯性模型中，攜帶CT基因型和TT基因型的個(gè)體發(fā)生精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)約是攜帶CC基因型個(gè)體的1.450和2.275倍。+3035 C/T位點(diǎn)的顯性模型(OR=1.547，95%CI：1.108～2.161，P=0.010)與精神分裂癥的易感性相關(guān)。在人類(lèi)基因組中常存在連鎖不平衡現(xiàn)象，可以用來(lái)定位參與疾病診療的相鄰變體，通過(guò)對(duì)HLA-G的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)這3個(gè)位點(diǎn)具有連鎖現(xiàn)象(R2<0.8)。通過(guò)對(duì)HLA-G 3′UTR單倍型分析發(fā)現(xiàn)，單倍型H3對(duì)精神分裂癥的發(fā)病具有保護(hù)作用(OR=0.663，95%CI：0.508～0.866，P=0.002)，而單倍型H4(ICG)可以增加患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.622，95%CI：1.098～2.397，P=0.014)。

綜上所述，HLA-G +3035 C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性與精神分裂癥的易感性相關(guān)，等位基因T可能是發(fā)生精神分裂癥的易感基因，從基因水平上研究了精神分裂癥可能的發(fā)病原因，可能為精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。本研究也存在一定局限性：本研究為單中心研究，且本研究的樣本量有限，可能會(huì)存在樣本偏倚，因此需要在多個(gè)地區(qū)、不同民族及人群中進(jìn)行驗(yàn)證，以此來(lái)降低研究結(jié)果的偶然性。此外，本次研究缺乏患者的生存數(shù)據(jù)， HLA-G 3′UTR多態(tài)性是否與精神分裂癥患者的生存有關(guān)需要進(jìn)一步研究。