高效液相色譜法測(cè)定酵素中γ-氨基丁酸

劉宗樂， 張展展， 尤曉亭， 高文惠*， 高林森

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所，河北石家莊 050050）

酵素是以動(dòng)物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品（索婧怡等，2020）。酵素中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、超氧化物酶、多酚、黃酮類物質(zhì)以及維生素等。γ-氨基丁酸（GABA）是酵素在發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的功能性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)GABAA、GABAB和GABAC這三種受體，GABA可以起到調(diào)節(jié)情緒（Kose等，2017）、改善睡眠質(zhì)量（Ahyun等，2021）和增強(qiáng)記憶力（Dashniani等，2020）等作用。此外，GABA在癲癇（Suchitra等，2020）、降血壓（Ngo等，2019）、糖尿病（Li等，2020）以及一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病（Sarasa等，2020）中發(fā)揮著有益作用。GABA在畜禽生產(chǎn)中可以提高機(jī)體免疫功能、改善產(chǎn)品品質(zhì)、提高生產(chǎn)性能等（付興周等，2018）。酵素具有多種生理功能，應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中可發(fā)揮諸多有益作用（簡(jiǎn)華峰等，2020），有望成為替代抗生素的新型飼料添加劑。目前，酵素作為一種功能性食品，GABA含量也已經(jīng)作為評(píng)價(jià)酵素的特征性指標(biāo)之一。因此，建立一種簡(jiǎn)單、靈敏，適用于檢測(cè)酵素中GABA含量的方法，對(duì)提高酵素產(chǎn)品質(zhì)量具有參考意義。

高效液相色譜法（HPLC）（Weng等，2021）、比色法（湯彩云等，2018）、氨基酸自動(dòng)分析儀（李放等，2016）、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLCMS/MS）（秦 宇 等，2020）、 高 效 薄 層 色 譜 法（HPTLC）（Sancheti等，2013）等是目前參考文獻(xiàn)中報(bào)道的有關(guān)GABA的主要檢測(cè)方法。與多數(shù)氨基酸一樣，GABA需要通過(guò)衍生化處理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的定量測(cè)定，常用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛（OPA）（王嘉怡等，2019）、丹磺酰氯（Somasundaram等，2017）、2，4-二硝基氟苯（段智紅等，2019）和異硫氰酸苯酯（李敏等，2015）等。本實(shí)驗(yàn)擬采用OPA作為柱前衍生化試劑，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，研究衍生時(shí)間和衍生溫度的影響，優(yōu)化并選擇檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相比例和柱溫條件，建立一種簡(jiǎn)單、靈敏，適用于酵素中GABA的定量分析方法，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，為酵素產(chǎn)品的開發(fā)以及評(píng)價(jià)酵素產(chǎn)品質(zhì)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 酵素樣品（自制和市售）；GABA標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥99%），上海源葉生物科技有限公司；OPA，β-巰基乙醇（99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司；氫氧化鈉、結(jié)晶乙酸鈉、冰乙酸、硼酸，均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器設(shè)備Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；UPT-I-10T超純水制備機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；ST3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，奧豪斯儀器有限公司；KH5200超聲波清洗儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SHB-3A循環(huán)水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取20.0 mg GABA標(biāo)準(zhǔn)品用水溶于10 mL容量瓶中，定容，得到2 mg/mL的母液，并依次稀釋為0.0001、0.0003、0.05、0.1、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于0～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

硼酸緩沖液的配制：稱取2.47 g硼酸溶于85 mL水中，用氫氧化鈉調(diào)pH=10.4，定容至100 mL，置于0～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

OPA衍生液的配制：準(zhǔn)確稱取10.0 mg OPA，超聲溶解于2.5 mL乙腈中，再加入β-巰基乙醇20 μL，置于0～4℃避光保存。

1.3.2 樣品處理 根據(jù)需要將不同酵素樣品稀釋一定倍數(shù)后，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待檢測(cè)使用。

1.3.3 衍生方法 由于GABA本身無(wú)紫外吸收，故標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中的GABA需要進(jìn)行衍生化處理，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定目標(biāo)物質(zhì)的目的。本實(shí)驗(yàn)采用OPA作為柱前衍生化試劑，使OPA與GABA在pH=10.4的硼酸緩沖液反應(yīng)體系下發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成具有紫外吸收的物質(zhì)，但該生成物的穩(wěn)定性差。因此，實(shí)驗(yàn)對(duì)衍生時(shí)間和衍生溫度的影響進(jìn)行了考察。

操作流程：在室溫下，用移液槍分別量取1.3.1配制的硼酸緩沖液600 μL、OPA衍生液120 μL以及GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液120 μL，混合，控制反應(yīng)時(shí)間為2 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，量取20 μL，立即進(jìn)樣分析檢測(cè)。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：XBridgeRC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉溶液（冰乙酸調(diào)pH=7.3），A:B=20:80（體積比）；流速：0.8 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.5 衍生時(shí)間的影響 在室溫條件下，選取同一質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，控制反應(yīng)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 min和7 min，按照1.3.4色譜條件快速進(jìn)樣分析檢測(cè)，以考察衍生時(shí)間對(duì)峰面積的影響。

1.3.6 衍生溫度的影響 選取同一質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在室溫、35、45、55℃和65℃下進(jìn)行衍生化處理，控制反應(yīng)時(shí)間為2 min，按照1.3.4色譜條件快速進(jìn)樣分析檢測(cè)，以考察不同衍生溫度對(duì)峰面積的影響。

1.3.7 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 按照1.3.3方法對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，衍生化反應(yīng)所生成的物質(zhì)在1.3.4色譜條件下經(jīng)過(guò)C18柱分離后進(jìn)入二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行光譜掃描，得到GABA衍生物的紫外吸收光譜圖后，根據(jù)紫外吸收和實(shí)際分離情況選擇最適檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.8 流動(dòng)相比例的選擇 在上述最佳衍生條件及固定色譜柱溫度為25℃，且其他色譜條件不變，設(shè)置流動(dòng)相乙腈與20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉的體積比為25:75、22:78、20:80和19:81，分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中GABA進(jìn)行洗脫分離，考察流動(dòng)相比例對(duì)分離情況的影響，以確定最佳流動(dòng)相比例。

1.3.9 柱溫的選擇 在上述最佳衍生條件及固定流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉溶液（體積比20:80），且其他色譜條件不變，設(shè)置柱溫為25、30、35、40℃，分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中GABA進(jìn)行分析檢測(cè)，考察柱溫對(duì)分離效果的影響，以確定最佳柱溫條件。

1.3.10 線性關(guān)系與檢出限 在室溫條件下，對(duì)1.3.1配 制 的 質(zhì) 量 濃 度 為0.0003、0.05、0.1、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的系列GABA標(biāo) 準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，控制反應(yīng)時(shí)間為2 min，按照1.3.4色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得相應(yīng)質(zhì)量濃度下GABA衍生物的峰面積，以考察質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系。將GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋，采用建立的方法進(jìn)樣檢測(cè)，并以基線噪聲的3倍確定其檢出限。

1.3.11 回收率和精密度的測(cè)定 在質(zhì)量濃度為0.001、0.01、0.1 mg/mL 3個(gè)添加水平下，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。取稀釋一定倍數(shù)后的酵素樣品，分別添加上述質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照

1.3.3 方法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行衍生化處理，在1.3.4色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。在上述條件下，各加標(biāo)樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.12 實(shí)際樣品的測(cè)定 采用實(shí)驗(yàn)建立的方法分別對(duì)6種自制或市售的酵素樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)所測(cè)得的峰面積，計(jì)算樣品中GABA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生時(shí)間的影響 由圖1可知，在所考察的衍生時(shí)間范圍內(nèi)，當(dāng)衍生時(shí)間增加，GABA衍生物的峰面積總體呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。在衍生時(shí)間為2 min時(shí)，檢測(cè)靈敏度最高，對(duì)應(yīng)GABA衍生物峰面積最大。因此選取2 min作為衍生化時(shí)間，且實(shí)驗(yàn)需要快速進(jìn)樣。

圖1 衍生時(shí)間對(duì)GABA衍生物峰面積的影響

2.2 衍生溫度的影響 由圖2可知，在不同衍生溫度下，對(duì)應(yīng)GABA衍生物峰面積間有著明顯差異。在所考察的衍生溫度范圍內(nèi)，當(dāng)衍生溫度升高時(shí)，由于OPA與GABA的衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，GABA衍生物的峰面積呈下降的變化趨勢(shì)。因此，選取室溫作為最佳衍生化溫度。

圖2 衍生溫度對(duì)GABA衍生物峰面積的影響

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇GABA衍生物經(jīng)C18柱分離后進(jìn)入二極管陣列檢測(cè)器在210～400 nm內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖3。GABA衍生物有2處特征吸收，分別為228 nm和334 nm。在最佳衍生條件下，設(shè)置波長(zhǎng)分別為228 nm和334 nm，固定其他色譜條件不變，進(jìn)樣分析檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在GABA衍生物響應(yīng)值高的228 nm波長(zhǎng)下，干擾峰較多?？紤]紫外吸收和實(shí)際分離情況，選擇334 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 GABA衍生物的紫外光譜掃描圖

2.4 流動(dòng)相比例的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相乙腈與20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉為不同比例時(shí)，酵素樣品中目標(biāo)物質(zhì)與其他成分的分離情況。酵素樣品在4種流動(dòng)相比例（乙腈與20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉的體積比為25:75、22:78、20:80和19:81）下的高效液相色譜分離圖如圖4所示。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈比例從25%到19%的過(guò)程中，隨著乙腈比例的降低，目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間逐漸增長(zhǎng)。當(dāng)流動(dòng)相A與B比例為25:75時(shí)，樣品中雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰重疊嚴(yán)重；當(dāng)流動(dòng)相A與B比例為22:78時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)色譜峰不能完全分離；當(dāng)流動(dòng)相A與B比例為20:80時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)基線分離，且無(wú)拖尾現(xiàn)象；當(dāng)流動(dòng)相A與B比例為19:81時(shí)，樣品中雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰完全分離，但分析時(shí)間較長(zhǎng)。綜合考慮，選擇體積比為20:80的乙腈-20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉作為流動(dòng)相。

圖4 流動(dòng)相比例的選擇

2.5 柱溫的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫條件下，酵素樣品中目標(biāo)物質(zhì)與其他成分的分離情況。酵素樣品在4種柱溫（25、30、35℃和40℃）條件下的高效液相色譜分離圖如圖5所示。結(jié)果表明，當(dāng)色譜柱溫度為40℃和35℃時(shí)，樣品中雜質(zhì)與GABA衍生物的色譜峰分離效果不佳。當(dāng)色譜柱溫度為30℃和25℃時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)均可以實(shí)現(xiàn)基線分離。雖然在柱溫30℃較25℃時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間有所提前，但考慮到樣品基質(zhì)的影響，為確保樣品中雜質(zhì)與GABA衍生物更好的分離，選用接近室溫的25℃作為柱溫。

圖5 柱溫的選擇

2.6 線性關(guān)系與檢出限 按照1.3.10方法對(duì)GABA質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系進(jìn)行考察，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）。GABA標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見圖7。質(zhì)量濃度在0.3 μg/mL～1 mg/mL線性關(guān)系好（R2=0.9997），并且線性范圍寬，線性回歸方程為y=11245x-73.995。以信噪比S/N=3確定檢出限為0.1 μg/mL。

圖6 GABA衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 GABA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

2.7 回收率和精密度的測(cè)定 按1.3.11方法進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。酵素樣品的平均加標(biāo)回收率為92.17%～104.29%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為0.51%～3.99%（n=5）。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)建立的方法準(zhǔn)確度和精密度良好，分析方法可靠，且適用于酵素產(chǎn)品中GABA含量的檢測(cè)。

表1 方法的回收率和精密度（n=5）

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定 按照1.3.12方法分別對(duì)自制和市售的6種酵素樣品進(jìn)樣檢測(cè)，并計(jì)算樣品中GABA的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，所測(cè)6種酵素樣品中均含有GABA，且含量在0.036～0.567 mg/mL。由于所測(cè)酵素樣品原材料、發(fā)酵工藝等方面的不同，使各酵素樣品間GABA的含量具有明顯差異。6種酵素樣品的高效液相色譜分離圖，如圖8所示。結(jié)果表明，采用實(shí)驗(yàn)建立的方法，酵素樣品中目標(biāo)物質(zhì)與其他成分具有良好的分離效果，而且該檢測(cè)方法較其他方法簡(jiǎn)單（湯彩云等，2018）、靈敏（李雁琴，2020；陳雪等，2017；李璐，2016）。

圖8 酵素樣品的HPLC色譜圖

表2 6種酵素樣品中GABA含量mg/mL

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以O(shè)PA作為衍生化試劑，在室溫下進(jìn)行衍生化處理，控制反應(yīng)時(shí)間為2 min，按照檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉溶液（體積比20:80），柱溫25℃，流速0.8 mL/min的色譜條件快速進(jìn)樣分析檢測(cè)，目標(biāo)色譜峰分離效果好，質(zhì)量濃度在0.3 μg/mL～1 mg/mL線性關(guān)系好（R2=0.9997），且線性范圍寬，檢出限為0.1 μg/mL，準(zhǔn)確度和精密度良好，所檢測(cè)的6種酵素樣品中GABA含量在0.036～0.567 mg/mL，不同酵素樣品間GABA含量具有明顯差異。實(shí)驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確可靠，適用于酵素產(chǎn)品中GABA含量的檢測(cè)。