番茄紅素的提取及抑菌作用研究

趙建英，張迎昭，李 祥，白 建

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033001）

圣女果又稱櫻桃番茄，含有多種營養(yǎng)素，可以促進消化，刺激食欲，治療厭食和食欲不振（白建等，2021）。番茄紅素是番茄里的主要色素，容易被氧化降解，可以作為抗氧化劑使用，清除并殺死自由基，而且番茄紅素還具有補氣生血、延緩衰老和抗肥胖功能。因此成為最受人們歡迎的營養(yǎng)保健品之一（曾敬等，2020）。金炳熔等（2020）通過小鼠試驗發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能夠改善哮喘小鼠肺組織病理學(xué)，得到番茄紅素具有抗哮喘作用的結(jié)論。王維等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以預(yù)防心腦血管疾病。李童等（2020）通過試驗用番茄紅素提取物制作面膜，所制得的面膜容易涂抹、氣味宜人、并且具有抗衰老能力。Paul等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能有效地幫助恢復(fù)與神經(jīng)退行性疾病、癲癇病、衰老、亞拉克諾德出血、脊髓損傷和神經(jīng)病變相關(guān)的典型行為和病理生理變化。Mirahmadi等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以調(diào)節(jié)信號通路及其蛋白質(zhì)，用于治療或預(yù)防前列腺癌。Stice等（2018）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能預(yù)防酒精性脂肪肝病和肝細(xì)胞癌發(fā)展。Kilany等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素具有抗肥胖潛力。Ladole等（2018）研究了超聲波和共固定酶對番茄皮的協(xié)同效應(yīng)，用于番茄紅素提取。陳俊杰等（2020）研究了超臨界CO2技術(shù)來萃取番茄紅素，并對這種技術(shù)進行了優(yōu)化。趙芳等（2020）探索了超微粉碎協(xié)同微波技術(shù)對番茄中的番茄紅素進行提取，并得到了比較好的結(jié)果。

本研究以新鮮圣女果為原料，采用乙酸乙酯萃取法，通過單因素試驗，確定最優(yōu)參數(shù)范圍，再通過設(shè)計正交試驗，對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到最適的提取條件，并對所提取的番茄紅素進行抑菌試驗，研究番茄紅素的抑菌效果穩(wěn)定性，為圣女果的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 圣女果購于呂梁市家家利超市；大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌由呂梁學(xué)院生命科學(xué)系微生物實驗室提供；0.5%山梨酸鉀溶液（分析純），乙酸乙酯（分析純），氫氧化鈉（分析純），無水乙醇（分析純），鹽酸（分析純）。瓊脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），牛肉膏（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），蛋白胨（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），氯化鈉（濟南坤豐化工有限公司）。

1.2 主要儀器pH計（FE20K）：梅特勒-托利多儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250）：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；紫外可見光分光度計（UV-1601）：北京瑞利分析儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考王海紅等（2017）的結(jié)論，首先使用蘇丹Ⅰ和無水乙醇以適當(dāng)比例混合，配制出質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、12 μg/mL的番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在473 nm處測定番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，通過所記錄的數(shù)據(jù)來制作并繪制番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 番茄紅素提取率測定 將番茄紅素提取液進行稀釋，使用分光光度計測定稀釋后的番茄紅素提取液的吸光度，利用線性回歸方程計算提取率。番茄紅素提取率計算公式為：

式中：C為通過線性回歸方程求得的番茄紅素的濃度，μg/mL；V為定容后的體積，mL；N為定容后稀釋的倍數(shù)；m為圣女果糊狀物的質(zhì)量，g。

1.3.3 番茄紅素提取 （1）清洗去皮：將新鮮圣女果進行清洗，去除外表皮和果蒂。（2）打糊：將處理后的圣女果放入榨汁機中打成糊狀。（3）浸提：稱取5 g圣女果糊，加入乙酸乙酯，置于恒溫水浴鍋中浸提。（4）過濾：浸提完成后，用濾紙進行過濾。（5）稀釋：取過濾后的提取液5 mL，稀釋10倍，在473 nm處測量吸光度。。

1.3.4 番茄紅素抑菌作用 （1）制作培養(yǎng)基：取牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl若干制作培養(yǎng)基。（2）滅菌：將經(jīng)過高溫煮沸的培養(yǎng)基裝入錐形瓶中，用棉花堵口，放入滅菌鍋，進行滅菌。（3）倒平板：將經(jīng)過濕熱高溫滅菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入經(jīng)過高溫蒸汽滅菌的平板中。（4）制菌懸液：分別刮取試管斜面上的菌種入無菌生理鹽水中，并將其稀釋成菌懸液備用。（5）接種：等平板凝固后進行接種。（6）平板劃線：進行平板劃線，標(biāo)明不同濾紙片在平板中所在的位置。（7）放濾紙片：將浸泡了不同溶液的濾紙片放入平板中，并相隔一定距離。（8）培養(yǎng)：將放入濾紙片的平板放入恒溫箱中培養(yǎng)24 h。（9）測量抑菌圈直徑：觀察濾紙片周邊的情況，對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進行記錄。

1.4 單因素試驗 預(yù)試驗：設(shè)定圣女果與乙酸乙酯料液比為1:3，提取溫度45℃，提取時間3 h，浸提pH為4，對番茄紅素的提取進行預(yù)試驗。分別研究不同料液比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL），不同提取溫度（25、35、45、55、65℃），不同浸提時間（1、2、3、4、5 h），不同浸提pH（2、4、6、8、10）對番茄紅素提取率的影響。

1.5 正交試驗設(shè)計 利用單因素試驗得出的數(shù)據(jù)，進行BBD響應(yīng)面法試驗（張環(huán)宇等，2020），以A提取時間、B提取溫度、C料液比、D浸提pH作為四個影響因素，以番茄紅素提取率為考察指標(biāo)。正交試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 正交試驗設(shè)計因素水平

1.6 抑菌試驗

1.6.1 番茄紅素的抑菌試驗 （1）配制培養(yǎng)基：按照標(biāo)準(zhǔn)配方稱取制作培養(yǎng)基的材料，加熱煮沸后將培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，先用棉花封口，再用報紙進行包扎。（2）滅菌與倒平板：將裝有處理過的培養(yǎng)基的錐形瓶放入滅菌鍋，進行滅菌操作，滅菌完成后，在無菌操作臺上進行倒平板操作。（3）制菌懸液：在無菌條件下制作菌懸液，吸取5 mL無菌水，將無菌水放到菌種斜面，用接種環(huán)慢慢刮下菌苔，塞上棉塞，并振蕩片刻。（4）取最佳提取條件提取所得的番茄紅素溶液備用。（5）取直徑6 mm的圓形濾紙片若干，取4個圓形濾紙片放入番茄紅素溶液中，取另外4個圓形濾紙片放入乙酸乙酯中，再取4個圓形濾紙片放入無菌水中，最后取4個圓形濾紙片放入山梨酸鉀溶液中。（6）待平板凝固后進行接種，取一個平板不進行接種，做空白對照，編號為1，另外分別取0.3 mL不同菌的菌懸液倒入另外3個平板中，用涂布棒抹勻，并將接種了大腸桿菌的平板編號為2，將接種了金黃色葡萄球的平板編號為3，將接種了枯草芽孢桿菌的平板編號為4。（7）在編號為1、2、3、4的平板中分別放入1個含有番茄紅素溶液的圓形濾紙片，1個含有乙酸乙酯的圓形濾紙片，1個含有無菌水的圓形濾紙片，1個含有山梨酸鉀溶液的圓形濾紙片，每個紙片間相隔較大距離。（8）將上述4個平板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，間隔一定距離并培養(yǎng)24 h。每組做三個平行試驗。（9）測量抑菌圈直徑：觀察濾紙片周邊抑菌圈的情況，對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進行記錄。

1.6.2 番茄紅素抑菌穩(wěn)定性試驗

1.6.2.1 不同溫度對番茄紅素抑菌效果的影響選用濾紙片法，將番茄紅素溶液分別于20、40、60、80、100℃下，加熱0.5 h，而后放入平板中進行恒溫培養(yǎng)，選擇未處理的番茄紅素溶液作為對照，觀察濾紙片周圍透明抑菌圈情況，記錄數(shù)據(jù)。

1.6.2.2 不同pH對番茄紅素抑菌效果的影響 選用濾紙片法，使用0.5 mol/L的NaOH或HCl溶液將番茄紅素溶液（pH）分別調(diào)節(jié)為2、4、6、8、10，以對應(yīng)未經(jīng)處理的番茄紅素溶液和對應(yīng)pH的NaOH或HCl溶液作為對照，常溫1 h后，進行恒溫培養(yǎng)，觀察濾紙片周圍透明抑菌圈情況，記錄數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理 使用Office Excel 2019整理數(shù)據(jù)，使用Graphpad Prism 8制圖。用SPSS 22.0進行正交試驗的方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 利用配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于波長473 nm處對吸光度進行測定，可以發(fā)現(xiàn)吸光度Y與番茄紅素濃度X之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其關(guān)系為Y=0.1049X-0.0011386，R2=0.9966（圖1），可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對番茄紅素含量進行分析。

圖1 番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 不同料液比對番茄紅素提取率的影響結(jié)果圖2表明，料液比對圣女果中番茄紅素的浸提提取率有十分明顯的影響，當(dāng)料液比為1:1～1:3時，番茄紅素的提取率呈現(xiàn)上升趨勢，在1:3時達到最大提取率。由此可知在料液比1:3時，番茄紅素的提取率達到峰值，料液比為1:3～1:5時，番茄紅素提取率趨于穩(wěn)定?？赡苁橇弦罕葹?:3時，番茄紅素已經(jīng)全部被提取出來。

圖2 不同料液比對提取率的影響

2.2.2 不同浸提溫度對番茄紅素提取率的影響結(jié)果 由圖3可以看出，在25～45℃，提取率與浸提溫度成正相關(guān)，這可能是因為溫度升高時，分子熱運動增快，圣女果中番茄紅素溶解速度加快。但溫度超過45℃時，浸提提取率變小，可能是因為溫度接近浸提劑的沸點，導(dǎo)致浸提劑揮發(fā)，番茄紅素分解，不能穩(wěn)定存在。由此可知，在進行番茄紅素的提取時，浸提溫度選擇45℃比較合適。

圖3 不同浸提溫度對提取率的影響

2.2.3 不同浸提時間對番茄紅素提取率的影響結(jié)果 從圖4可以看出，浸提時間對圣女果中番茄紅素的提取率有影響，當(dāng)提取時間為1～4 h時，提取率明顯呈現(xiàn)上升趨勢，并且在4 h時番茄紅素的提取率達到峰值，但提取時間為4～5 h時，番茄紅素的提取率有下降趨勢，可能是由于浸提時間超過最大限度，色素不能穩(wěn)定存在。

圖4 不同浸提時間對提取率的影響

2.2.4 不同浸提pH對番茄紅素提取率的影響結(jié)果 從圖5可以看出，浸提pH為2～6時，隨著浸提pH的增加，番茄紅素的提取率逐漸上升，當(dāng)pH＞6時，番茄紅素的提取率相較于之前有明顯的下降。可能是因為在強堿環(huán)境下，由于發(fā)生未知反應(yīng)導(dǎo)致番茄紅素不能穩(wěn)定存在，導(dǎo)致提取率變低。另外當(dāng)浸提pH＜4時，提取率有較大幅度的下降，可能是在強酸條件下，番茄紅素不能穩(wěn)定存在。

圖5 不同浸提pH對提取率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果與分析 正交試驗設(shè)計結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

從表2的數(shù)據(jù)可以得出，最優(yōu)提取工藝為A3B1C3D2，即圣女果與乙酸乙酯的料液比為1:4，浸提溫度45℃，提取時間5 h，提取pH為6。其中，料液比、提取時間和提取溫度引起的番茄紅素提取率的改變較大，而提取環(huán)境pH引起的番茄紅素提取率的改變較小。從表3的各項數(shù)據(jù)可以得出，料液比和浸提時間引起的提取率變化呈極顯著差異，浸提溫度引起的提取率變化達到顯著水平。

表2 正交試驗設(shè)計方案與試驗結(jié)果

表3 方差分析

另外，通過正交試驗結(jié)果進行極差與方差分析可得，浸提劑的多少是影響提取率的重要因素之一，而通過單因素試驗可知料液比1:3和料液比1:4的差距較小，從經(jīng)濟角度來看，選用料液比1:3更加合理。而在浸提時間的選用方面，在單因素試驗中，提取時間為4 h和提取時間為5 h的提取率相比較接近，沒有明顯差異，所以為了節(jié)省提取時間，可以把浸提時間設(shè)置為4 h。其次，浸提溫度是影響提取率的一個重要因素，在浸提溫度為45℃時提取率達到最大，但當(dāng)溫度大于45℃后，提取率開始減小。因此，溫度選擇45℃比較合適。最后，在浸提pH的選擇上，通過單因素試驗的結(jié)果可以看出，在pH為2或pH為10的條件下，番茄紅素的提取率與其他條件下相差較大，可能是由于這兩種條件下提取液中發(fā)生未知反應(yīng)導(dǎo)致番茄紅素不能穩(wěn)定存在于浸提劑中，導(dǎo)致提取率變低。因此可以得出進行番茄紅素提取的最優(yōu)pH為6。

綜上所述，進行提取的最優(yōu)條件是圣女果與乙酸乙酯的料液比為1:3，溫度為45℃，浸提時間為4 h，提取pH為6。根據(jù)最優(yōu)條件進行三次試驗，所得到的提取率為56.19 μg/g，優(yōu)于正交試驗結(jié)果和預(yù)試驗結(jié)果。

2.4 抑菌試驗結(jié)果

2.4.1 番茄紅素抑菌試驗結(jié)果 由表4可知，在作為對照的平板1中放入帶有各種溶液的濾紙片，抑菌圈直徑均為6 mm，說明未接種菌種的平板中濾紙片周圍未形成透明抑菌圈。平板2、3、4中放有無菌水濾紙片，乙酸乙酯濾紙片的抑菌圈直徑為6 mm，說明帶有這兩種溶液的濾紙片周圍未形成透明抑菌圈，由此可知無菌水、乙酸乙酯對這三種菌類沒有抑制作用。而番茄紅素濾紙片和山梨酸鉀濾紙片的抑菌圈直徑均大于6 mm，說明這兩個濾紙片周圍有透明抑菌圈形成?？梢钥闯觯鸭t素和山梨酸鉀對這三種菌類均有一定的抑制作用。

表4 各個平板內(nèi)的濾紙片抑菌圈直徑

2.4.2 番茄紅素抑菌穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.2.1 不同溫度對番茄紅素抑菌穩(wěn)定性的影響由表5可知，通過改變溫度，當(dāng)溫度在20～60℃時，番茄紅素試驗組的抑菌圈直徑與對照組之間并無明顯差距；而當(dāng)溫度在80～100℃時，番茄紅素試驗組的抑菌圈直徑明顯小于對照組；這說明番茄紅素的抑菌效果在20～60℃比較穩(wěn)定，而當(dāng)溫度升高到60℃以上時番茄紅素的抑菌效果會降低，可能是由于溫度過高，番茄紅素不能穩(wěn)定存在。

表5 溫度對番茄紅素抑菌穩(wěn)定性的影響mm

2.4.2.2 不同pH對番茄紅素抑菌效果的影響由表6可知，不同pH對番茄紅素的抑菌效果有比較明顯的影響，當(dāng)pH在4～8時，試驗組番茄紅素的抑菌圈直徑與對照組番茄紅素的抑菌圈直徑相比無明顯差異；但是當(dāng)pH為2或10時，試驗組番茄紅素的抑菌圈直徑與對照組番茄紅素的抑菌圈直徑相比有明顯的減小，可能是因為在強酸或強堿條件下，番茄紅素的活性被破壞，導(dǎo)致番茄紅素抑菌效果降低。由此可以得出，在pH在4～8時，番茄紅素的抑菌效果比較穩(wěn)定；在pH為2或10時（有沒考慮強酸或強堿本身這三種菌就不適合生長，pH設(shè)在中性左右，間隔也可小些，間隔1或0.5），可能由于發(fā)生未知反應(yīng)，導(dǎo)致番茄紅素的抑菌效果不穩(wěn)定。

表6 pH對番茄紅素抑菌效果的影響mm

3 結(jié)論

該試驗以圣女果為原料，通過單因素試驗，分析單因素試驗結(jié)果，并設(shè)計正交試驗，通過綜合分析，得出的最佳提取條件為：料液比1:3，提取溫度45℃，浸提時間4 h，浸提pH 6。根據(jù)該條件進行提取，番茄紅素提取率可達56.19 μg/g；同時通過抑菌試驗，對其抑菌作用進行研究，得到了番茄紅素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用。在20～60℃、pH為4～8條件下，番茄紅素的抑菌效果有良好的穩(wěn)定性。