超聲法與閃式提取法提取梔子中梔子苷的工藝對比研究

崔 悅， 周新新，2， 湯鑫淼，2， 李樂樂， 林曉影， 馮 波， 關 皎*， 朱鶴云*

（1.吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林吉林 132013；2.延邊大學藥學院，吉林延吉 133002）

梔子又稱黃梔子、山梔，為茜草科植物梔子的干燥成熟果實，能夠瀉火除煩、涼血解毒、清熱利濕。我國中部和南部地區(qū)為其主要產(chǎn)地（阿潤等，2021；趙夢亭等，2021）。梔子中的主要化學成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物，其中以梔子苷含量最高。近幾年，由于梔子具有無副作用和綠色環(huán)保等顯著優(yōu)勢，梔子及其副產(chǎn)品被廣泛應用于飼料添加劑，其不僅可以降低畜禽抗生素類物質(zhì)攝入量，還可以有效減少其血糖及膽固醇含量，從而最大化提高畜禽副產(chǎn)品的品質(zhì)，同時也為人類食品健康與安全提供有效保障（成祖斌等，2021）。

目前，梔子苷的提取方法主要包括：超聲法（歐陽薇等，2016；黃弦等，2013；吳亞超等，2011）、回流提取法等（康艷萍等，2018）。文獻中鮮見多種方法提取梔子苷的比較性研究。閃式提取法可將藥材與提取溶劑快速機械混合以在短時間內(nèi)將溶劑滲透到藥材組織中實現(xiàn)快速的提?。ɡ铥惖?，2020；劉建新等，2016；武艷梅等，2011）。本文以梔子苷的提取率作為評價指標，采用不同的因素和水平進行正交試驗。通過正交試驗分別篩選出超聲法和閃式提取法的最佳提取工藝并進行驗證，并比較兩種方法經(jīng)最佳提取工藝得到的梔子苷的提取率，確定梔子中梔子苷的最佳提取工藝，為梔子在飼料領域的應用以及后續(xù)的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-500GVDV型三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JHBE-50S型閃式提取器（河南金鼐科技發(fā)展有限公司）。梔子藥材購自吉林省吉林市，經(jīng)吉林醫(yī)藥學院鑒定為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis.）的干燥成熟果實，梔子苷對照品（純度＞98%，批號：19101705），購自成都普菲德生物技術有限公司。

1.2 梔子苷含量測定方法學考察

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Shim-pack GIST柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，SHIMADZU），預柱為C18保護柱（4.0 mm×10 mm，5 μm），流動相為0.1%甲酸水-乙腈（85:15，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為238 nm，柱溫為35℃；進樣量為10 μL。梔子苷對照品與梔子樣品的色譜圖見圖1。

圖1 梔子苷（A）和梔子樣品（B）HPLC色譜圖

1.2.2 對照品溶液的制備 取梔子苷對照品適量，精密稱定，以甲醇作為溶劑配制成1 mg/mL的對照品儲備液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取梔子藥材粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱定重量，超聲功率為150 W，提取0.75 h，待至室溫后再次稱重，并將減失的重量用50%乙醇補足，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，至10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，臨用前用流動相稀釋20倍作為超聲法的供試品溶液。

1.2.4 標準曲線的制備 取對照品儲備液，精密吸取適量，以甲醇為溶劑配制成梔子苷系列對照品溶液5、10、20、50、100、200 μg/mL，進樣分析，以峰面積為縱坐標（Y），梔子苷溶液濃度為橫坐標（X），進行線性回歸計算。

1.2.5 精密度試驗 以濃度為50 μg/mL的梔子苷對照品溶液作為待測樣品，按照上述色譜條件進樣6次，計算峰面積的RSD值。精密度試驗得RSD為1.4%，即方法精密度符合要求。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 取梔子藥材適量，制備得到梔子樣品溶液，分別于室溫放置0、4、8、12、24 h后進樣分析并計算RSD值。穩(wěn)定性試驗RSD為1.3%，即樣品穩(wěn)定性符合要求。

1.2.7 重復性試驗 取同一批梔子樣品共6份，制得供試品溶液并分析，計算RSD。重復性試驗RSD為0.7%，即方法重復性符合要求。

1.2.8 準確度試驗 取已知梔子苷含量的梔子藥材適量，分別加入相當于梔子苷含量80%、100%、120%的對照品溶液，進樣分析，并計算其回收率和RSD。準確度試驗梔子苷的平均回收率為98.1%（RSD=1.3%），即方法準確度符合要求。

1.2.9 含量測定 取供試品溶液，采用HPLC方法測定，各樣品平行操作3次，代入標準曲線計算梔子苷含量。

1.3 梔子苷提取工藝的單因素考察 分別設置乙醇濃度10%、30%、50%、70%、90%，超聲法的提取時間為0.25、0.5、0.75、1、1.25 h；閃式提取法的提取時間分別為1、2、3、4、5 min，料液比分別為1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 g/mL和超聲法選取的功率分別為50、100、150、200、250 W為考察因素和水平，篩選出影響梔子飼料添加劑提取的較優(yōu)水平。

1.3.1 超聲法提取梔子中的梔子苷 以乙醇濃度（A）、時間（B）、功率（C）和料液比（D）為4個考察因素，各因素包括3個水平，采用L9（34）設計試驗，各因素水平見表1。

表1 超聲法因素水平

1.3.2 閃式提取法提取梔子中的梔子苷 以乙醇濃度（A）、料液比（B）和時間（C）3個因素，采用L9（34）設計正交試驗，各因素水平見表2。

表2 閃式提取法因素水平

1.3.3 超聲法與閃式提取法提取效果對比 以各方法最佳工藝提取梔子苷并進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制 分別以峰面積為縱坐標（Y），梔子苷溶液濃度為橫坐標（X），進行線性回歸計算。經(jīng)線性回歸計算得Y=1.598×104X-1.048×104（r=0.9998）。結(jié)果表明，梔子苷在濃度為5～200 μg/mL時線性關系良好。

2.2 單因素考察結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度 超聲法和閃式提取法中考察不同乙醇濃度對梔子苷提取率的影響，選取的乙醇濃度分別為10%、30%、50%、70%、90%，料液比均為1:50（g/mL）。其中，超聲法試驗中超聲時間0.75 h，超聲功率為150 W；閃式提取法試驗中，提取時間3 min。將提取后得到的供試品溶液進樣分析，測定樣品中梔子苷的含量。由圖2（A）、圖3（A）知，無論是超聲法還是閃式提取法梔子苷的提取率都隨乙醇濃度升高而升高，當升高至70%后提取率開始下降，故70%乙醇為最佳提取溶劑。

2.2.2 提取時間 超聲法和閃式提取法中考察不同提取時間對梔子苷提取率的影響，其中超聲法的提取時間分別為0.25、0.5、0.75、1、1.25 h，超聲功率為150 W；閃式提取法的提取時間分別為1、2、3、4、5 min；兩種方法均采用50%乙醇作為提取溶劑，料液比均為1:50 g/mL。將提取后的供試品溶液進樣分析，測定樣品中梔子苷的含量。由圖2（B）、圖3（B）知，無論是超聲法還是閃式提取法梔子苷的提取率都隨提取時間的增加而升高，當達到一定時間后最后趨于穩(wěn)定。其中，超聲法的最佳提取時間為0.75 h，閃式提取法的最佳提取時間為3 min。

2.2.3 料液比 超聲法和閃式提取法中考察不同料液比對梔子苷提取率的影響，選取的料液比分別為1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 g/mL。其中超聲法的提取時間為0.75 h，超聲功率為150 W；閃式提取法的提取時間為3 min；兩種方法均采用50%乙醇作為提取溶劑。將提取后的供試品溶液進樣分析，測定樣品中梔子苷的含量。由圖2（C）、圖3（C）知，無論是超聲法還是閃式提取法梔子苷的提取率都隨提取料液比的增加而升高，當料液比達到1:60 g/mL后，提取率基本保持不變。故超聲法和閃式提取法的最佳提取料液比均為1:60 g/mL。

圖3 閃式提取法單因素試驗結(jié)果

2.2.4 功率 超聲法中超聲功率也會對梔子苷的提取率有一定影響，故也應該對超聲功率進行單因素考察。選取的功率分別為50、100、150、200、250 W。以50%乙醇作為提取溶劑，提取時間為0.75 h，料液比為1:50 g/mL。將提取后的供試品溶液進樣分析，測定樣品中梔子苷的含量。由圖2（D）知，梔子苷的提取率隨超聲功率的增加而升高，超聲法的最佳提取功率為250 W。

圖2 超聲法單因素試驗結(jié)果

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 超聲法提取梔子中的梔子苷 以梔子苷提取率（%）為考察指標，并取樣品3份對最佳工藝進行驗證。正交試驗和方差分析結(jié)果分別見表3、表4。

表3 超聲法正交試驗結(jié)果

表4 超聲法方差分析結(jié)果

由表4可知，各因素對梔子苷提取率的影響順序為C＞D＞B＞A，各因素對提取工藝無顯著性影響。超聲法最佳工藝為A3B3C2D1，即70%乙醇，提取1 h，功率200 W，料液比1:40。取供試品3份，按此工藝驗證，梔子苷平均提取率為6.90%，表明此為超聲法最佳工藝。

2.3.2 閃式提取法提取梔子中的梔子苷 以梔子苷提取率（%）為考察指標，并取樣品3份對最佳工藝進行驗證。各因素水平、正交試驗和方差分析結(jié)果分別見表5、表6。

表5 閃式提取法正交試驗結(jié)果

表6 閃式提取法方差分析結(jié)果

由表6可知，各因素對梔子苷提取率影響順序為A＞B＞C，各因素對試驗結(jié)果均無顯著性影響。閃式提取法的最佳方案為A1B2C3，即30%的乙醇，料液比1:50，提取3 min。取供試品3份，按此工藝驗證，梔子苷平均提取率為6.21%，高于正交試驗的最高提取率（5.78%），表明此工藝為閃式提取法最佳工藝。

2.4 超聲法與閃式提取法提取效果對比 由表7可知，超聲法提取率略高于閃式提取法，但其時間為閃式提取法的20倍，且閃式提取法乙醇濃度相對較低，綜合料液比等因素，其更加環(huán)境友好、省時高效。

表7 不同方法提取梔子苷的提取率

3 結(jié)論

由超聲法和閃式提取法提取梔子中梔子苷的單因素試驗和正交試驗結(jié)果可知，超聲法的最佳提取工藝為70%乙醇，提取1 h，功率200 W，料液比1:40，提取率為6.90%；閃式提取法最佳提取工藝為30%乙醇，料液比1:50，提取3 min，提取率為6.21%。超聲法提取率略高于閃式提取法，但綜合考慮乙醇濃度、料液比、提取時間等多種因素，閃式提取法更省時節(jié)能，適于對梔子中梔子苷的現(xiàn)代化提取，可為梔子在飼料領域的應用及開發(fā)提供一定參考。