蘇黃止咳膠囊提取物多糖含量的測(cè)定方法研究

李超 豐杰 鄭悅 張海平 劉小清

蘇黃止咳膠囊源于國(guó)醫(yī)大師晁恩祥教授“風(fēng)咳”理論名醫(yī)名方[1]，是“風(fēng)咳”證獨(dú)家治療藥物，申請(qǐng)到了“風(fēng)咳”適應(yīng)癥的專利，保護(hù)期為 20 年。是針對(duì)感冒后咳嗽和咳嗽變異性哮喘等亞急性、慢性咳嗽開(kāi)發(fā)的獨(dú)家產(chǎn)品，西醫(yī)《咳嗽的診斷與治療指南》（2021 版）[2]唯一推薦中成藥。該藥功效為疏風(fēng)宣肺，止咳利咽，由九味中藥材組成，采用中藥提取與制劑工藝，對(duì)紫蘇葉、前胡提取揮發(fā)油，麻黃、五味子采用乙醇提取有效成分，地龍等五味藥材水提醇沉，制得浸膏減壓干燥后得到干膏粉，與揮發(fā)油包合物、藥用輔料混合制粒，整粒灌裝后最終得到蘇黃止咳膠囊。其中，地龍等五味藥材水提醇沉，制得浸膏減壓干燥后得到的干膏粉，因其富含多糖，具有很強(qiáng)的引濕性，直接影響制劑產(chǎn)品的質(zhì)量，是中藥硬膠囊劑普遍存在的頑疾[2-3]。為此，有必要建立提取物中多糖含量的檢測(cè)方法，以增加制劑工藝過(guò)程控制，提升產(chǎn)品質(zhì)量。本研究主要對(duì)蘇黃止咳膠囊提取物中多糖的含量測(cè)定條件進(jìn)行研究。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[3-5]，選用最常用的苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)，以D-無(wú)水葡萄糖為對(duì)照，采用紫外分光光度法，建立提取物中多糖的含量測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 儀器與試劑 UV-2550 型紫外分光光度計(jì)（島津公司）；XPE105 型電子天平（梅特勒-托利多）；HHS-21-8 型水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）。

蘇黃止咳膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20103075，規(guī)格：45 g，生產(chǎn)單位：北京海燕藥業(yè)有限公司）提取物由北京海燕藥業(yè)有限公司自制；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、蒽酮等均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；D-無(wú)水葡萄糖，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，純度99.8%。

1.1.2 供試液的配制 精密稱取蘇黃止咳膠囊提取物，研細(xì)混勻，取約10 mg，至100 mL 容量瓶中，加入70.0%乙醇溶液定容至刻度，搖勻。精密量取5 mL，至200 mL 容量瓶中，純化水定容至刻度，搖勻，即得。

1.1.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，純化水定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液。

1.2 方法

多糖的含量測(cè)定方法主要分兩大類：一類是利用組成多糖的單糖縮合反應(yīng)而建立的方法，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法；另一類是直接測(cè)定多糖，如氣相色譜法和高效液相色譜等。中藥材多糖種類繁多，分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，這給直接測(cè)定多糖增加了難度。

故采用多糖的單糖縮合反應(yīng)建立蘇黃止咳膠囊提取物中多糖的測(cè)定方法，利用多糖在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)來(lái)測(cè)定，即苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，故苯酚-硫酸法在紫外490 nm 處有最大吸收，蒽酮-硫酸法在紫外620 nm 處有最大吸收[6-8]。

1.2.1 苯酚-硫酸法顯色及測(cè)定條件的選擇

1.2.1.1 濃硫酸加入量考察 量取供試液2 mL 至試管中，加入4% 苯酚溶液1 mL，選擇加入濃硫酸體積5、7、9 mL，各制備5 份樣品，搖勻，至100℃水浴中加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。取適量倒入比色皿中，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液中多糖的吸光度。結(jié)果顯示，反應(yīng)后樣品溶液的吸光度RSD 值分別為3.1%、2.1%、4.8%，優(yōu)選濃硫酸加入體積為7 mL。

1.2.1.2 冰浴時(shí)間考察 量取供試液2 mL 至試管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至100℃水浴中加熱30 min，選擇不同的冰浴時(shí)間3、5、10 min 后，冷卻至室溫。取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液中多糖的吸光度。結(jié)果顯示，反應(yīng)后樣品溶液的吸光度RSD 值分別為1.36%、0.89%、1.65%，故冰浴時(shí)間確定為5 min。

1.2.1.3 水浴溫度的考察 量取供試液2 mL 至試管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至水浴中加熱，分別設(shè)置水浴溫度40、80、100℃，時(shí)間30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液中多糖的吸光度，考察15 min 內(nèi)樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，水浴溫度為100℃時(shí)，反應(yīng)后樣品溶液的吸光度RSD 值分別為2.1%、0.158%、0.155%，故水浴溫度確定為100℃。

1.2.1.4 確定最佳顯色條件 量取供試液2 mL 至試管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至水浴溫度100℃條件下加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。在15 min 內(nèi)，取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液中多糖的吸光度。

1.2.1.5 D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，加純化水定容至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。量取儲(chǔ)備液1、2、3、4、5 分別至50 mL 容量瓶中，用純化水定容至刻度即得5 個(gè)不同濃度的D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別吸取2 mL D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至試管中，加入4% 苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至100℃水浴中加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。另取純化水2 mL，操作同上，加苯酚硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，作為空白對(duì)照。分別取適量倒入比色皿中，于 490 nm 處測(cè)定上述溶液吸光度值，以D-無(wú)水葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.1323x+0.1347，相關(guān)系數(shù)R2=0.9913，D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度在3.261～16.303 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光值之間呈良好的線性關(guān)系，符合郎伯-比爾定律。

1.2.2 蒽酮-硫酸法顯色及測(cè)定條件的選擇

1.2.2.1 蒽酮-硫酸溶液用量的確定 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時(shí)以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4、5 和6 mL，各制備5 份樣品，搖勻，混勻后沸水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值。結(jié)果顯示，反應(yīng)后溶液的吸光度RSD 值分別為3.1%、4.3%、4.8%，優(yōu)選濃硫酸加入體積為4 mL。

1.2.2.2 水浴溫度的考察 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時(shí)以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，混勻后分別置于80、90 和100℃水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值。結(jié)果顯示，反應(yīng)后溶液的吸光度RSD 值分別為1.12%、0.56%、0.17%。即水浴溫度為100℃時(shí)，樣品吸光度RSD 值最小，優(yōu)選水浴溫度100℃。

1.2.2.3 水浴時(shí)間的考察 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時(shí)以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL 搖勻，混勻后在100℃的沸水浴中分別顯色10、15、20 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值。結(jié)果顯示，反應(yīng)后溶液的吸光度RSD 值分別為3.10%、2.46%、5.07%，即水浴時(shí)間為15 min 時(shí)，樣品吸光度RSD 值最小，優(yōu)選水浴時(shí)間為15 min。

1.2.2.4 確定最佳顯色條件 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時(shí)以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，混勻后在100℃的沸水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值。

1.2.3.5 D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，加純化水定容至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。量取儲(chǔ)備液1、2、3、4、5 分別至50 mL 容量瓶中，用純化水定容至刻度，即得5 個(gè)不同濃度的D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別吸取2 mL D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至試管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，至100℃水浴中加熱15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中。另取純化水2 mL，操作同上，作為空白對(duì)照。分別于620 nm 處測(cè)定上述溶液的吸光度值，以D-無(wú)水葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.0 487x-0.0 082,相關(guān)系數(shù)R2=0.9 897，D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度在4.127～18.219 μg/mL范圍內(nèi)與吸光值之間呈良好的線性關(guān)系，符合郎伯—比爾定律。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，線性方面，苯酚-硫酸法線性相關(guān)性優(yōu)于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法的精密度更高，方法更可靠。測(cè)量準(zhǔn)確度方面，蒽酮-硫酸法的檢測(cè)結(jié)果略高于苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法可能與供試品中非糖物質(zhì)發(fā)生了縮合反應(yīng)，影響了測(cè)量精度。為確保蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的穩(wěn)定、可靠。最終選用苯酚-硫酸法作為蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的測(cè)定方法，并開(kāi)展了重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性的方法研究[9-11]。

2.1 重復(fù)性

取同一份供試品，按照1.1.2 項(xiàng)下供試液配制方法，平行制備6 份供試品溶液，按照1.2.1.4 項(xiàng)下的最佳顯色條件測(cè)定吸光值，6 份供試品溶液中多糖含量的RSD 為1.5%，小于2.0%的接受標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明苯酚-硫酸法測(cè)定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的方法重復(fù)性良好。

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

取同一份供試品，按照1.1.2 項(xiàng)下的供試液配制方法，平行制備6 份供試品溶液，按照1.2.1.4 項(xiàng)下的最佳顯色條件測(cè)定吸光值，6 份供試品中多糖含量的RSD 為0.7%，小于2.0%的接收標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.3 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

取與精密度實(shí)驗(yàn)相同的供試品，另一實(shí)驗(yàn)員按照1.1.2 項(xiàng)下的供試液配制方法，平行制備6 份供試品溶液，按照1.2.1.4項(xiàng)下的最佳顯色條件測(cè)定吸光值。兩名實(shí)驗(yàn)員12 份樣品中多糖含量的RSD 為1.7%，小于2.0%的接收標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明中間精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

按照1.1.2 項(xiàng)下的供試液配制方法，配制一份供試液，按照1.2.1.4 項(xiàng)下的最佳顯色條件，每隔10 min 測(cè)定一次供試液的吸光度，1 h 內(nèi)連續(xù)檢測(cè)供試品溶液中多糖的含量，多糖含量的RSD 為0.3%，小于2.0% 的接受標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明苯酚-硫酸法測(cè)定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的方法穩(wěn)定性良好。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，苯酚-硫酸法測(cè)定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的方法，精密度良好，重復(fù)性良好，方法的中間精密度良好，顯色反應(yīng)后1 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。供試品溶液中多糖含量的RSD 小于2.0%。

3 討論

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法是常用測(cè)定多糖含量的方法，方法簡(jiǎn)單、快速易推廣[12-14]。實(shí)驗(yàn)時(shí)，苯酚-硫酸法基本不受檢測(cè)過(guò)程中可能存在的蛋白質(zhì)影響，先加入苯酚試劑，再加入濃硫酸，濃硫酸的加入觸發(fā)反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)完成生成穩(wěn)定的化合物，故精密度、準(zhǔn)確度、反應(yīng)穩(wěn)定性較好。但由于分次加入試劑，可能加入一致性略有差異，重復(fù)性略有降低。蒽酮-硫酸法測(cè)出的是溶液中全部可溶性碳水化合物總量，回收率略高；此外，因?yàn)橐淮涡约尤胼焱噭?，故反?yīng)起點(diǎn)準(zhǔn)確，重復(fù)性較好。大量文獻(xiàn)顯示，針對(duì)不同的研究對(duì)象、實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果略有不同。

本研究以蘇黃止咳膠囊提取物多糖含量測(cè)定作為研究對(duì)像，分別采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法進(jìn)行多糖含量檢測(cè)，得出了苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法的最佳顯色條件。苯酚-硫酸法測(cè)定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的最佳顯色條件為：移液管量取供試液2 mL 滴入試管中，加入4%的苯酚溶液1 mL，隨后加入7 mL 濃硫酸，充分搖勻，放置至100℃水浴中加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度。蒽酮-硫酸法測(cè)定提取物中多糖含量的最佳顯色條件為：移液管量取供試品溶液2 mL 滴入試管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，將混合溶液放置至100℃水浴中顯色15 min，然后將混合溶液迅速置于冰水中冷卻，待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測(cè)定樣品溶液的吸光度[9-11]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，苯酚-硫酸法制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好[15]，檢測(cè)結(jié)果精密度高，方法準(zhǔn)確度較好，控制硫酸加入量、反應(yīng)環(huán)境等，可以實(shí)現(xiàn)方法的高重復(fù)性和穩(wěn)定性。故苯酚-硫酸法可作為蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量測(cè)定的首選方法，方法穩(wěn)定、可靠、簡(jiǎn)單、易于操作。

本文建立的蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量測(cè)定方法，有效監(jiān)控中藥提取物中多糖吸濕物質(zhì)的含量，為蘇黃止咳膠囊提取物中間產(chǎn)品控制提供了監(jiān)測(cè)方法和控制指標(biāo)，有利于提升制劑產(chǎn)品質(zhì)量，減少內(nèi)容物吸濕性問(wèn)題，減少膠囊殼易脆碎問(wèn)題，提升產(chǎn)品顧客滿意度。為其他中藥提取物制定中間產(chǎn)品控制標(biāo)準(zhǔn)提供了手段和思路。