水稻細胞間磷酸鹽高效循環(huán)再利用的機制解析

趙紅玉，徐 磊，易可可

（中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

磷素是地殼中含量較為豐富的非金屬元素，它也是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，其高效吸收及利用對于植物正常生長發(fā)育至關重要。植物主要通過根系以磷酸鹽的形式吸收土壤中的磷素養(yǎng)分。但由于磷酸鹽在土壤中易被固定而難以被植物吸收利用，在田間生產過程中，主要是通過大量的加施磷肥來克服其容易固定的特點。盡管磷肥的大量使用極大地促進了作物的產量，但當季施用的磷肥只有15%～30%能被作物吸收利用。這也導致了當前我國大量的耕地總磷含量高，而作物能吸收利用的有效磷含量相對較低。同時，大量的施加磷肥也會引起水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題，嚴重影響到現代農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。近期，Nature有報道指出，與石油資源的不可再生性類似，磷礦石為農用磷肥的主要來源，有可能在50～100年之后消耗殆盡[1]。因此，農業(yè)的安全可持續(xù)發(fā)展要求我們減少磷肥的使用量，這一目標可以通過提高作物自身的磷吸收效率(根系從土壤中吸收磷的能力)和利用效率(磷在作物體內的循環(huán)再利用效率)來實現。而要提高作物磷素吸收利用效率，要求我們更加清楚地解析作物吸收利用磷素的分子生理機制。

目前，對于作物中磷素信號調控網絡及其調節(jié)磷素吸收機制的認識較為完善。其中，調節(jié)作物體內磷素信號網絡的核心調控因子是一類含有MYBCC結構域的轉錄因子PHRs (phosphate starvation response)家族蛋白。PHRs主要通過結合下游磷饑餓誘導表達基因啟動子區(qū)域的P1BS順式作用元件來調控基因表達[2–3]。如，水稻中的磷信號核心轉錄因子OsPHR2可以直接結合磷酸鹽轉運體OsPT2的啟動子，進而調控水稻的磷素吸收平衡[4]。而近期的研究發(fā)現，一類負調控因子SPX (根據SYG1、Pho81和XPR1命名)家族蛋白也參與了PHR類轉錄因子響應磷素供應的活性調控[5–6]。如，在水稻中SPX4能負調控磷信號，正常供磷條件下該蛋白會與OsPHR2蛋白結合，阻礙其進入細胞核內并抑制其與下游的磷饑餓誘導表達基因(如高親和磷酸轉運體等)的啟動子結合，從而不啟動缺磷信號[7]。在低磷脅迫條件下，由于細胞內IP8含量的下降，導致SPX4與PHR2復合體解聚。而解聚的SPX4蛋白與SDEL1和SDEL2兩個E3泛素連接酶結合，并被泛素化修飾而降解，最終釋放PHR2進入細胞核內從而啟動下游的磷饑餓誘導基因的表達，促進水稻磷素吸收能力[8]。因此，SPX蛋白也被認為是植物體內磷素狀況的感應器，參與核心轉錄調節(jié)器PHRs蛋白的活性調控。最近的研究發(fā)現PHR2能被E3泛素連接酶HRZ2結合，并被泛素化修飾而降解[9]。這些磷信號網絡重要調控因子及其降解調控機制的解析能更好地幫助我們理解作物磷素養(yǎng)分高效吸收機制。此外，基于對這些重要調控因子和下游磷酸鹽吸收轉運體的認知，我們可以非常方便的通過遺傳改良提高作物從外界吸收磷素的能力。如，在水稻中增強表達PHRs和磷酸鹽轉運體PT等蛋白、敲除負調控因子SPXs，都能創(chuàng)制磷素高效吸收，從而提高植株磷含量的水稻種質[6,10]。但真正在田間應用這些基因和調控因子進行作物磷素養(yǎng)分高效改良，目前仍少有成功案例。究其原因，主要是我們對于磷素養(yǎng)分在植株體內循環(huán)再利用的認知缺乏。

與作物中對磷素信號調控網絡調節(jié)磷素吸收分子機制認知較為完善的現狀不同，磷素信號調控網絡如何介導作物磷素養(yǎng)分體內高效利用，尤其是體內磷素循環(huán)再利用的分子生理機制至今仍不清楚。盡管部分參與調節(jié)器官間磷素分布的調控因子已經相繼被鑒定。如，PHO1是一類SPX-EXS類蛋白，其主要在植物根系的木質部表達，參與根系吸收的磷酸鹽在木質部導管的加載。該基因功能喪失的水稻和擬南芥突變體都表現出了地上部磷素含量低的缺陷[11–12]。而PHO2是一類E2 泛素結合酶，能夠介導PHO1蛋白的降解，從而影響磷素在地上與地下部間的分配。與之相應，PHO2功能喪失的水稻和擬南芥突變體都表現出地上部磷素高積累的表型[13–15]。但作物體內組織細胞間磷酸鹽循環(huán)再利用的重要功能基因，如韌皮部磷素回流再利用的重要轉運體，至今尚不明確；且老葉片中的磷素如何周轉再利用，及其與磷素信號調控網絡間的互作機制至今仍不清楚。

導致這種問題的主要原因之一是我們仍缺乏經濟高效檢測組織細胞磷素分布的技術和方法[16]。目前常見的磷含量化學測定方法都是對植物樣品進行破壞性取樣后，利用樣品中提取的磷酸鹽與特殊化合物(如鉬酸銨和酒石酸銻鉀)特異反應，并在特殊條件下形成帶色絡合物，從而進行磷素含量的定量測定。這些化學方法受制于取樣方法和測定技術，難以原位對植物細胞組織中磷素進行精準測定。后期也有部分技術通過X射線熒光光譜或31P-NMR核磁共振譜等物理原理對植物樣品中磷素進行測定或成像。但這類方法都需要采用昂貴的儀器設備，且無法高效地進行組織細胞磷素含量測定。近年來，也有科學家通過利用基于熒光共振能量轉移(FRET)原理創(chuàng)制磷酸鹽熒光指示蛋白，并利用該類指示蛋白對細胞內磷酸鹽含量進行檢測和測定。如Sahu等[17]通過利用該類蛋白對擬南芥根系細胞質中的磷酸鹽濃度進行了測定，發(fā)現根系細胞處于不同發(fā)育階段及外界磷酸鹽供應不同時，其細胞質中的磷含量展現出了一定的變異。但這些技術需要創(chuàng)制相應的轉基因材料，且需要利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。同時，細胞質內的磷酸鹽濃度一般保持在較穩(wěn)定的水平，主要受到液泡中儲存磷酸鹽的緩沖。該類技術也不利于我們高效地檢測植物細胞內磷酸鹽含量的動態(tài)變化。因此，為了更好的理解磷素信號調控網絡及重要功能基因如何影響體內磷酸鹽的循環(huán)再利用，我們急需發(fā)展高效經濟的組織細胞水平磷酸鹽檢測技術。

液泡磷酸鹽的儲存和利用對于作物磷素利用效率起著重要作用。在細胞水平，超出細胞代謝所需的磷酸鹽由PHT5家族蛋白運輸入液泡內儲存，作為儲備用于緩沖細胞磷素需求[18–19]。而這部分液泡儲存的磷酸鹽，能夠在細胞需要時通過VPE1和VPE2蛋白釋放到細胞質中進行利用[20]。且在外界磷素供應不足時，原來儲存在液泡中的磷酸鹽不僅要釋放到胞質中供細胞代謝所需，甚至要調運到新葉中進行再利用。VPE蛋白對于水稻體內磷素再利用起著非常重要的作用，該類基因的突變將導致老葉中的磷素運輸到新葉途徑受阻。因此，進一步解析PHT5和VPE家族基因協同作用機制，將有利于我們明確液泡磷酸鹽儲存平衡對于磷素內部再利用的重要作用，并為提高水稻地上部磷素再利用效率提供理論基礎和技術。

植物地上部磷素再利用，尤其是老葉中磷素要提供給新葉進行再利用，都需要將磷酸鹽通過韌皮部的伴胞細胞加載到篩管細胞，使其隨著韌皮部溶液回流供應給其它組織器官。因此，磷酸鹽在韌皮部的伴胞細胞加載到篩管細胞的過程對于磷素的再利用起著非常重要的作用。而影響該加載過程的磷酸鹽轉運體是這一再利用途徑的關鍵基因。但參與調控韌皮部磷素回流再利用的重要轉運體，至今尚不清楚。

因此，建立高效經濟的植物細胞水平磷酸鹽檢測技術，并利用該技術解析水稻體內組織細胞間磷酸鹽的循環(huán)再利用機制，從而為創(chuàng)制磷素高效利用水稻品種提供理論基礎和手段。

該項目研究內容與方案：

1)高效經濟的植物細胞水平磷酸鹽分布檢測技術建立和完善：借助不同化學染料，結合植物組織細胞處理及切片等技術，創(chuàng)建高效經濟的植物細胞水平磷酸鹽分布檢測技術。并通過對已報道影響磷素吸收轉運重要功能基因相關突變體進行系統(tǒng)檢測，進一步驗證和完善染色技術系統(tǒng)。

2)水稻磷素內部再利用關鍵功能基因克隆及其調控轉錄因子鑒定：結合反向遺傳學，借助韌皮部傷流液磷酸鹽含量測定等技術，分離并鑒定韌皮部磷酸鹽加載重要轉運體和參與磷素由老葉到新葉轉運的重要功能基因。借助協同表達分析等生物信息學手段，鑒定調控磷素內部再利用關鍵調控因子，如調節(jié)韌皮部磷酸鹽加載轉運體表達的轉錄因子基因。

3)水稻磷素內部再利用關鍵功能基因及其調控轉錄因子介導植株內磷酸鹽分配機制解析：對獲得的潛在影響水稻磷素內部再利用的轉運體基因及其調控因子相關遺傳材料進行功能解析。并借助細胞水平磷酸鹽檢測技術，對相關遺傳材料在不同供磷條件下進行精細分析。

4)磷信號調控網絡與磷素內部再利用關鍵功能基因和調控轉錄因子的遺傳分析：利用實驗室長期研究的水稻磷信號調控網絡核心調控因子PHR2、SPXs等，通過與鑒定的水稻磷素內部再利用關鍵調控轉錄因子進行相關遺傳材料雜交，進行遺傳分析，并建立相關遺傳調控網絡。

5)水稻組織細胞間磷酸鹽循環(huán)再利用的分子生理調控網絡構建及應用：結合遺傳分析工作結果，選取水稻組織細胞間磷酸鹽循環(huán)再利用的重要調控因子相關遺傳材料進行轉錄組、ChIP-seq等分析，從而構建相關轉錄調控網絡。同時，結合表型分析，對部分重要節(jié)點進行遺傳改良，測試相關遺傳材料在不同供磷條件下的磷素養(yǎng)分利用效率，并評價其潛在應用前景。