潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系分析

李源, 姚碩,段超,丁勇

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種影響大腸黏膜和黏膜下層的特發(fā)性炎癥。該疾病的特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作，若控制不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性器官損傷，出現(xiàn)功能受損、解剖學(xué)變化(鉛管狀結(jié)腸)、發(fā)育不良和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[1]。UC臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏膿膿、便血，若病情進(jìn)展不及時(shí)治療，可導(dǎo)致貧血、消瘦、低蛋白血癥和水電解質(zhì)紊亂[2-3]。UC的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，并且與腸道菌群、免疫系統(tǒng)疾病、遺傳、環(huán)境和心理因素均相關(guān)[4-5]。Toll樣受體4(TLR4)是TLRs家族中識(shí)別微生物和炎癥的主要成員。以往的研究發(fā)現(xiàn)，UC患者中存在TLR4基因的多態(tài)性[6]。此外，TLR4激活可促進(jìn)NF-κB p65易位至細(xì)胞核，進(jìn)而觸發(fā)各種炎癥和免疫相關(guān)介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[7]。NOD受體蛋白3(NLRP3)炎性小體是一種蛋白復(fù)合物，由NLRP3蛋白、接頭蛋白相關(guān)半點(diǎn)樣蛋白(ASC)與半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)組成。最近的研究結(jié)果表明，NLRP3炎性小體的激活可能在各種代謝疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，例如2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化，并且NLRP3通路與幾種自身免疫和自身炎癥反應(yīng)性疾病有關(guān)，包括痛風(fēng)、家族性地中海熱、冷吡啉相關(guān)自身炎癥綜合征、多發(fā)性硬化癥和腎淀粉樣變性[8]。目前，暫無相關(guān)研究分析UC患者疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測指標(biāo)?；诖耍狙芯客ㄟ^分析UC患者外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至2021年6月收治的95例UC患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合UC診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，并經(jīng)過結(jié)腸鏡檢查并黏膜活組織檢查確診；②患者知情并簽署同意書，本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2019LLX0604)；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腸梗阻、腸穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥；②合并血液系統(tǒng)疾?。虎酆喜L(fēng)濕性疾??；④合并自身免疫性疾??；⑤合并嚴(yán)重心、肺、腎部疾?。虎迖?yán)重認(rèn)知障礙者；⑦處于妊娠期或哺乳期。根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為輕度組(n=53)、中度組(n=26)和重度組(n=16)，輕度組男31例，女22例；年齡35～69歲，平均(55.83±3.31)歲。中度組男14例，女12例；年齡33～70歲，平均(55.15±3.76)歲。重度組男10例，女6例；年齡36～69歲，平均(56.07±3.35)歲。另選取同期健康體檢者40例作為對(duì)照組。對(duì)照組男18例，女22例；年齡32～73歲，平均(56.43±4.28)歲。四組基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

所有患者均于入組后1 d的清晨收集空腹靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管中，上下顛倒5次，采用Ficoll密度梯度離心分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)印跡法測定外周血TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1表達(dá)。通過總蛋白抽提試劑盒提取樣本總蛋白，采用二喹琳甲酸(BCA)法進(jìn)行定量，以SDS-聚丙烯凝膠電泳分析，通過電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移至羥甲基纖維素膜，一抗雜交，二抗雜交，信號(hào)檢測參照Thermo PIERCE底物顯色試劑盒說明書，并采用圖像分析軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)

①對(duì)比不同嚴(yán)重程度UC患者外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)水平。②根據(jù)UC患者疾病轉(zhuǎn)歸情況分為轉(zhuǎn)歸組和未轉(zhuǎn)歸組，對(duì)比兩組外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)水平。疾病轉(zhuǎn)歸[10]：患者腹痛癥狀減輕，少量便血或無血便，水電解質(zhì)恢復(fù)正常，發(fā)熱消失。③統(tǒng)計(jì)分析外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)對(duì)UC患者疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測價(jià)值。④采用多因素Logistic回歸分析外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)UC患者疾病轉(zhuǎn)歸的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 四組外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)水平比較

重度組外周血TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1表達(dá)高于中度組、輕度組和對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 四組外周血TLR4、NLRP3炎性小體蛋白免疫印跡(Western Blot)

表1 四組外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)水平比較

2.2 轉(zhuǎn)歸組和未轉(zhuǎn)歸組外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)水平比較

轉(zhuǎn)歸組外周血TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1表達(dá)低于未轉(zhuǎn)歸組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)歸組和未轉(zhuǎn)歸組外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)水平比較

2.3 外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測價(jià)值

以逐步Logistic回歸模型中的概率值作為四者聯(lián)合診斷值。ROC曲線顯示，TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1聯(lián)合預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸的AUC為0.923，高于TLR4的0.766、NLRP3的0.711、ASC的0.754、caspase-1的0.763，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.687、3.614、2.699、2.688，均P<0.05)，見表3，圖3。

表3 外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測價(jià)值

2.4 多因素分析UC患者疾病轉(zhuǎn)歸影響因素

將UC患者疾病轉(zhuǎn)歸情況(未轉(zhuǎn)歸組=1，轉(zhuǎn)歸組=0)作為因變量，將TLR4(>8.76=1，≤8.76=0)、NLRP3(>4.09=1，≤4.09=0)、ASC(>12.92=1，≤12.92=0)、caspase-1(>4.55=1，≤4.55=0)作為自變量，進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果顯示，TLR4表達(dá)>8.76、NLRP3表達(dá)>4.09、ASC表達(dá)>12.92、caspase-1表達(dá)>4.55均為影響UC患者疾病轉(zhuǎn)歸的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表5。

圖3 外周血TLR4、NLRP3炎性小體表達(dá)對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測ROC曲線

表4 多因素分析UC患者疾病轉(zhuǎn)歸影響因素

3 討論

UC是一種比較常見的消化道疾病，主要由多因素引起的腸道免疫功能失衡導(dǎo)致。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國UC的發(fā)病率為11.6/10萬人，且呈上升趨勢[11]。目前，尚不清楚UC的確切病因，其治療的主要目的為控制病情急性發(fā)作、維持癥狀緩解和促進(jìn)黏膜愈合[12-13]。國外一項(xiàng)研究顯示，組織學(xué)活動(dòng)度可用于預(yù)測UC患者的臨床復(fù)發(fā)[14]。國內(nèi)刁凌云等研究顯示，IL-1、IL-6、TNF-α等因子在UC病情進(jìn)展方面起著重要的作用[15]。

TLR4是一類跨膜受體，其可通過識(shí)別外源性細(xì)菌脂多糖，并激活促炎細(xì)胞因子、趨化因子的分泌，引發(fā)炎癥反應(yīng)來破壞入侵病原體。本研究中，重度組外周血TLR4表達(dá)高于中度組、輕度組和對(duì)照組(P<0.05)，提示TLR4表達(dá)與UC患者病情密切相關(guān)，與郁麗亞等研究結(jié)果類似[16]。TLR4是把雙刃劍，低水平的TLR4可通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并維持黏膜完整性和腸道上皮穩(wěn)態(tài)。另一方面，TLR4異常表達(dá)可激活下游細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而加重黏膜損傷，進(jìn)而參與UC病情的進(jìn)展。本研究中，轉(zhuǎn)歸組外周血TLR4表達(dá)低于未轉(zhuǎn)歸組(P<0.05)；多因素分析顯示，TLR4表達(dá)為影響UC患者疾病轉(zhuǎn)歸的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，提示TLR4表達(dá)可作為疾病轉(zhuǎn)歸評(píng)估的重要指標(biāo)。El-Sherbiny等研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路可有效減少結(jié)腸炎性細(xì)胞因子，抑制UC相關(guān)的結(jié)腸炎癥負(fù)荷[17]。

炎性小體是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其失調(diào)激活可能導(dǎo)致感染性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默癥等[18-19]。本研究中，重度組外周血NLRP3、ASC、caspase-1表達(dá)高于中度組、輕度組和對(duì)照組，提示NLRP3炎性小體表達(dá)與UC患者病情密切相關(guān)。研究指出，NLRP3炎性小體可通過促進(jìn)促炎性IL-1β的成熟和釋放，在炎癥的起始和結(jié)腸炎的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[20]。部分微生物(尤其是奇異變形桿菌)可以通過募集的炎性巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎性體誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生，從而促進(jìn)IL-1β依賴性炎癥和腸道損傷。本研究中，轉(zhuǎn)歸組外周血NLRP3、ASC、caspase-1表達(dá)低于未轉(zhuǎn)歸組(P<0.05)；多因素分析顯示，NLRP3、ASC、caspase-1表達(dá)為影響UC患者疾病轉(zhuǎn)歸的高危因素，提示NLRP3炎性小體表達(dá)可作為疾病轉(zhuǎn)歸評(píng)估的重要指標(biāo)。國外的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NLRP3表達(dá)可改善腸道炎癥[21]。此外，NLRP3炎性小體還在腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，其可通過IL-18依賴性地增加杯狀細(xì)胞的粘液產(chǎn)生來保護(hù)粘膜[22]。ROC曲線顯示，TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1聯(lián)合預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸的AUC高于單一指標(biāo)，提示TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1聯(lián)合預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測效能較好。

綜上所述，外周血TLR4、ASC、caspase-1表達(dá)與UC患者病情進(jìn)展密切相關(guān)，且可用于評(píng)估疾病轉(zhuǎn)歸情況。